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基因显微注射法及注意点

2022-03-30 10:02阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/1446908511

该方法是 Gordon等人发明的，基本原理是通过显微注射仪将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内，使外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。1982年Palmiter应用此法获得转基因的“超级小鼠”引起世人瞩目。以后相继获得了转基因猪、绵羊、兔、牛、山羊等。此法的优点在于:外源DNA分子大小基本不受限制，每次注射外源基因长度可达50kb；外源DNA在宿主动物染色体上的整合率高，可达到30%；方法相对简单，导入过程直观。其缺点是:外源基因是否能稳定地整合到受体基因组中,要等到子一代出生后以后经过选择才能确定，这对许多生育周期长、产仔数少的大家畜来讲，效率就很低；整合位点随机，易造成宿主基因组内生命活动所必需的基因失活和导致胚胎或动物死亡；整合一般是多拷贝首尾串联相接，不利于研究基因的结构、功能及表达调控。该法是研究转基因动物最早、最普遍采用的方法，也是最成熟的方法。
下面以转基因小鼠的培育为例，对基因显微注射法的基本操作步骤进行介绍。
1)目的基因的制备与纯化
目的基因可以来源于：通过限制性内切酶预先分离的某一基因；逆转录法得到的cDNA；人工合成的DNA片段；聚合酶链式反应(PCR)扩增的特定基因片段。目的基因的克隆可以通过载体方式进行，通常选择质粒作为载体。将目的基因与质粒结合形成重组子，然后转化至E.coli，扩增质粒，再分离纯化重组质粒DNA，用适当的限制性内切酶消化，制备成线状基因片段备用。目的基因的克隆也可以通过PCR来实现。
2)卵供体母鼠和假孕母鼠的准备

定期准备相当数量的卵供体母鼠和假孕母鼠以及一批相对稳定的正常雄鼠与结扎雄鼠。
3)超排卵与取卵
选择4~6周龄母鼠，注射孕马血清促性腺激素(PMSG)后，隔42~48h再注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)，注射HCG后10~13h剖取卵，用培养液保存，置CO2培养箱备用。
4)基因显微注射
用专门的持卵管和注射针在显微注射仪上操作，将纯化的目的基因注射到受精卵雄性原核内(雄性原核较雌性原核大)。
5)受精卵移植
转基因受精卵在单细胞至桑葚胚阶段移植到受孕后0.5d的假孕母鼠的输卵管，在囊胚期则移植到受孕后2.5d的假孕母鼠子宫。每只假孕母鼠移植20~30个转基因卵为宜。
6)目的基因的表达整合鉴定和检测
从假孕母鼠产下的幼鼠尾尖提取DNA，用PCR、 DNA印迹、FLSH(荧光原位杂交)等方法在染色体及基因水平上进行整合鉴定，并通过 Northern blot(RNA印迹)和 Western blot(蛋白质印迹)等方法在转录及蛋白质水平上进行表达检测。经检测获得阳性Founder小鼠(首建鼠)。
7)建系
将阳性 Founder小鼠与同一品系的正常小鼠交配，检测F1代仔鼠的阳性率，当繁殖到阳性率为50%左右时基本上可以判断出外源目的基因为单一位点的整合。经扩大繁殖，从中选择外源目的基因表达效果好、适应性好的转基因小鼠进行近亲繁殖。然后从子代中选择理想的纯合子个体进行全同胞兄妹交配，建立遗传基因小鼠近交系。
注意点：
第一：注射入雄原核的理由：
1、雄原核相比于雌原核更大，更容易操作；
2、雄原核位置更好；
动物细胞转基因方法——显微注射的几个问题


图示可见雌原核的位置有极体阻隔，不方便注射。
3、雄原核的基因组物质处于解凝集的状态，更适合外源DNA的重组。可以联想能够受精的成熟卵细胞实际处于减数第二次分裂的中后期状态，遗传物质时高度螺旋化的。
第二，显微注射前卵细胞的处理。

卵细胞外有放射冠，是卵外的卵丘细胞（颗粒细胞）在细胞间由透明质酸组成的基质，显微注射前用酶处理。一般用一定浓度的透明质酸酶处理以提高成功率。

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