原文地址：怎样解析难结晶蛋白的结构？
2007年的一个帖子：
本来也许应该放在最后的，但是我决定还是写在最前面的。
我想告诉大家，通过这次journal club，大家可以学到什么
新浪博客
2007年的一个帖子：
本来也许应该放在最后的，但是我决定还是写在最前面的。
我想告诉大家，通过这次journal club，大家可以学到什么
.
如果你对结构生物学一无所知：
通过这篇文章，你应该知道，结构解析有两个方法
NMR:用于解析比较小的蛋白，小于25kD，比较快速、简单。
复合物，大的蛋白：比较适合用晶体结构、共结晶。
如果你稍微懂一些结构生物学：
通过这篇文章,你可以知道蛋白结构解析的瓶颈是如何得到可溶蛋白，
通过FPLC可以很简单就可以知道两个蛋白是不是相互作用。
如果你比较了解结构生物学：
你只要知道有一种可以得到可溶蛋白的新方法就可以了。
anyway，希望每一个读到这篇文章的人，都可以得到自己的收获。
首先我们来看看这篇文章，是nature structure（全称NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY）上的一篇文章。nature structure 差不多是结构生物学领域最好的一篇杂志，影响因子12左右。
全文应该非常容易找到。
先简要介绍一下这篇文章。
这篇文章的主要内容或者亮点吧
1、提出了一种用于在一个全长蛋白中寻找可溶片段的方法。（ESPRIT）
2、第一次用这种方法得到了禽流感病毒RNA聚合酶亚基PB2中最C端的一个可溶片段。并用NMR方法解析这个这个片段的结构。并且用细胞生物学方法研究了这个片段in
3、用晶体方法得到了这个片段和一个核孔运输蛋白的复合体的结构。
这篇文章所要研究的一个蛋白是禽流感病毒RNA聚合酶中的一个亚基PB2.
RNA聚合酶是禽流感病毒中非常重要的一个蛋白，含有三个亚基PA,
它在病毒的生活史中有两个方面的功能：
1、转录病毒基因组中所编码的蛋白。
2、复制整个病毒基因组。
正因为禽流感危害较大，这个蛋白又非常的重要，所以研究的特别的多，本文所研究的是PB2亚基，大小为759个氨基酸。
目前在世界各地所采集的许多禽流感病毒株中，发现了很多的点突变，这些突变造成的巨大的危害之一就是能够是禽流感病毒，可以更换宿主，或者说能够让它感染哺乳动物，包括人。所以大家都很想弄清除的这些点突变的作用机理是什么。其中有些重要的点突变就是在RNA聚合酶的PB2亚基中。但是这些点突变的机制很难研究，因为到目前为止还没有可用的原子结构。
这是因为:一直得不到可溶的RNA聚合酶的亚基。没有了可溶的蛋白，就无法利用NMR或者X-ray晶体衍射解析其蛋白结构。
因为得到可溶性的蛋白，是蛋白解析结构的前提。无论是NMR还是x-ray都首先需要的到可溶的蛋白。既然PB2的全长无法得到可溶表达，那么很多人都会想到克隆表达全长蛋白中的一个domain或者片段。但是由于目前关于禽流感RNA聚合酶生物信息学的知识非常的匮乏，无法用软件预测PB2全长蛋白中的domain的位置。
怎么办呢？
ESPRIT：翻译过来就是：(通过）随机增加末端切掉片段表达可溶蛋白。
通过名字我们也能猜出这种方法的含义：既然我们不知道全长蛋白中，哪一段单独表达会是可溶的，就只能通过随机的方法来寻找。我们可以从一个全长蛋白的N端或者C端（本文用的是从N端）随机的减掉一个AA，这样把任何一个可能都尝试了，就有可能找到可溶的片段。
PB2全长是759个AA，那么我们从N端一个一个切，那么我们如果得到759个construct就可以包括所有的可能了（C端也同样，但是本文没有做）。
理论上我们可以通过PCR实验，设计不同的引物，应该也可以实现，但是这样无论成本、劳动力都太大了。本篇文章用的就是一个创新的方法。
简单的描述一下：
就是首先将PB2基因查到PGEX中，然后用一种限制性酶切酶从5‘端把Pb2切开，然后用核酸外切酶3来处理，每隔一定时间取样，然后处理成平末端，用T4DNA连接酶重新连接成环，转化到DH5a中，提出痕量质粒转化到BL21中，然后检测可溶表达情况。
这里，我要补充一下，他们检测蛋白是否可溶的方法也比较新颖，通常我们在实验室都是用超声破碎，取全蛋白和上清分别取样跑胶比较而判断的。但是这种方法无法适合大规模的筛选。
本文用的方法，就是通过克隆的方法，在PB2基因的C末端加了14个AA的短肽，这个短肽能够在大肠杆菌体内被生物素修饰，在体外当加入fluorescent
附，文章详细的方法的protocol。
自己总结的。
其实大家不用很详细的看。了解基本原理即可，知道有这么一种方法也就足够。
1
(PCR:pb2+14biotin
2
(Not
3
(transform
4
(nitrocellulose
5
(lysed
6
通过荧光检测就能得到能够可溶表达的片段了。
通过PCR，就很容易知道，可溶表达的片段了，最终的结果找了两个片段：678–759
通过NMR方法就非常容易解析到了这个domain的结构，是一个含有helix和beta-sheet的结构，左图是10个结构，右图是平均结构。
![[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？](http://s15.sinaimg.cn/bmiddle/002h16y4gy6U0dLPQeife&690 "[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？")
结构生物学的文章，如果想发的比较好，一般有两个条件要满足的，第一，蛋白结构的本身笔记新颖，是一个新的fold。第二，一般都要和功能相互联系，能够用来解析生物现象才最好，通俗的说，结构解析出来之后，还要做一些生物实验或者功能实验。
这个结构DPDE，通过和目前已知的结构库（dali)相比较得知，是一个全新的结构。
另外作者还做了生物学的实验：
1、DPDE的细胞定位。
2、和其他蛋白的相互作用。
通过这些，使得文章的水平非常高。
关于这两个细胞生物学的实验，我会简单的讲，因为我想大家对这个课题本身的兴趣并不是很大，除非你就是研究“禽流感病毒蛋白”的。
首先DPED的细胞定位实验。
通过将DPED和PB2全长和EGFP相连，从而研究比较，他们的细胞定位。
然后将感兴趣的几个部分又做了点突变，并观察对细胞定位的影响。
结论是，他们的细胞定位是一致的，都是细胞核定位，并以此，以及序列比对，提出了一个新的细胞核定位信号：KRx12–15KRxR
![[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？](http://s11.sinaimg.cn/bmiddle/002h16y4gy6U0dMhsFk4a&690 "[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？")
第二个生物学实验：研究DPDE和Importin
为了验证他们是不是相互作用，作者用了一个最简单、但是确是最实用的方法，FPLC的方法
图示：
a
b
C
因为在importin的峰里，看到了DPDE的存在，很明显就证明了他们在体外是可以相互作用的。
详细的讲，是：
（您好。我对蛋白质相互作用这块比较感兴趣。但上句是不是应该表述成：
C
因为在importin的峰里，取样做电泳，检测到了DPDE的存在，很明显就证明了他们在体外是可以相互作用的。
多谢指教。）
这个方法的优点：非常简单，结果非常的明了。缺点就是，不太适合两个分子量接近的蛋白。而且，只能看到是否结合，却无法定量，只能定性。
anyway，我们还是可以很多时候考虑用这种方法的。
![[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？](http://s10.sinaimg.cn/bmiddle/002h16y4gy6U0dMI4yt69&690 "[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？")
上面所讲的通过FPLC验证二者可以相互作用，但是这种方法，却无法得知他们是如何相互作用的，也就是说，无法得知，他们确切的相互作用的机理、方式。
![[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？](http://s9.sinaimg.cn/bmiddle/002h16y4gy6U0dN70a4a8&690 "[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？")
于是作者通过共结晶的方法解析了importin
下面是他们的复合体的晶体结构，红色的部分是DPDE的结构。
![[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？](http://s12.sinaimg.cn/bmiddle/002h16y4gy6U0dNvVi3bb&690 "[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？")
上面所讲的通过FPLC验证二者可以相互作用，但是这种方法，却无法得知他们是如何相互作用的，也就是说，无法得知，他们确切的相互作用的机理、方式。
于是作者通过共结晶的方法解析了importin
下面是他们的复合体的晶体结构，红色的部分是DPDE的结构。
具体的相互作用方式：
![[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？](http://s14.sinaimg.cn/bmiddle/002h16y4gy6U0dNVJp36d&690 "[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？")
通过分析复合物的结构，找出相互作用的位点，通过点突变，进行验证。
方法还是FPLC。
![[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？](http://s12.sinaimg.cn/bmiddle/002h16y4gy6U0dOlDT5cb&690 "[转载]怎样解析难结晶蛋白的结构？")
总结：
之所以将这一篇作为journal
1、他用到了NMR和X-ray这两者解析蛋白结构解析的方法。
2、他告诉我们结构生物学的瓶颈：拿到可溶的蛋白。并提出了一种行之有效的解决方案。
3、他用最典型的方式来阐述了结构如何和功能相联系起来。
4、他用了最简单、直接的方法解决问题：FPLC、点突变、细胞定位。
在这个帖子里，强调的是，世上本无路，走的人多了，也就有了路。不管这路是不是最合适的。
问个问题,我是结构学的外行-.-
随便弄一段可溶片段然后送去分析结构,就可以确定该结构是存在于正常的蛋白质结构中的一部份么?
还是说..这个根本就是结构生物学中的基本常识?
完全不懂了,求教!
一般来说，从来没有“随便”弄一段的说法。
在结构生物学中，像这篇文章中的一个C端的domain，因为从结构上分析，它和前面的区域之间有一个很长的loop，在结构上被认为是形成了一个独立的domain，也许和前面的domain有相互作用，但是事实上，这个domain的独立结构和在整个蛋白中的结构一般认为不会有变化的。
所以在很多文章中，都是拿很多独立的domain作为研究对象：当然不是随便弄一段的呵呵
那就是说还是建立在domain
我没有看原文(比较懒嘿嘿),但是通过看帖子描述,前半部分方法是先快速采样，再确定domain的过程，就是说类似screening,事先其实并不知道哪一段是可溶的;
再次求教，谢谢
ESPRIT：翻译过来就是：(通过）随机增加末端切掉片段表达可溶蛋白。
通过名字我们也能猜出这种方法的含义：既然我们不知道全长蛋白中，哪一段单独表达会是可溶的，就只能通过随机的方法来寻找。我们可以从一个全长蛋白的N端或者C端（本文用的是从N端）随机的减掉一个AA，这样把任何一个可能都尝试了，就有可能找到可溶的片段。
PB2全长是759个AA，那么我们从N端一个一个切，那么我们如果得到759个construct就可以包括所有的可能了（C端也同样，但是本文没有做）。
理论上我们可以通过PCR实验，设计不同的引物，应该也可以实现，但是这样无论成本、劳动力都太大了。本篇文章用的就是一个创新的方法。
简单的描述一下：
就是首先将PB2基因查到PGEX中，然后用一种限制性酶切酶从5‘端把Pb2切开，然后用核酸外切酶3来处理，每隔一定时间取样，然后处理成平末端，用T4DNA连接酶重新连接成环，转化到DH5a中，提出痕量质粒转化到BL21中，然后检测可溶表达情况。
是这个没错吧?
然后是
就这里不太懂,
按之前说的,分析结构一般是以一个独立的domain为单位做NMR和XRAY分析的,这篇文章得到的可溶性片段是直接拿去分析结构了还是先作prediction然后再去分析结构?
如果是直接分析,那如何断定这个片段没有因为'按时间取样'而丧失一定的完整性
如果是后者,那为什么不用传统的方式直接将predicted的domain克隆到vector里去
我真的仔细看了这个帖子了-_-..
可能理解能力有限,还是觉得这个文章有些,奇怪...不好意思
你找到了问题的关键，可能是我没有交代清楚。
你说的很对，通常情况下，我们都是通过预测从而找到domain的。
但是这个蛋白所有的同源蛋白，都没有解析出来结构，所以我们无法predict出来哪里可以形成独立的domain，而只能像这篇文章用的方法，把所有的可能的片段都找出来，然后看看哪些片段可以形成独立折叠的domain。
predict的基础是同源蛋白已经有了结构才可以。
但是对于没有同源结构的，只能用本文的方法了，虽然成本很高呵呵
看完之后，有一个问题
他用的方法确实很新颖，用外切核酸酶来获得从C端开始的全部长度的基因片段，虽然他也可以用类似的方法来获得从N端开始的全部片段，
但是，这样获得的片段都有一个固定的起点，要么C端，要么N端
那么，如何获得在基因内部的某段序列，并且筛选它是否是具有某种结构的domain呢？
我想，能不能参考它的方法继续进行下去，现在他已经确定了C端的一个可溶性domain和一个loop，那么，我们可以用loop上的某个aa作为新的C端起点，用同样的方法进行筛选，那么会不会得到下一个可溶性domain呢？再以这个domain的终点aa作为下一次筛选的起点，从而完成对全序列的筛选？当然，我们也可以同时从N端开始筛选，从两边向中间靠拢，这样速度会更快。
另外，我还有一个问题，（我不是学结构，可能比较弱）
文章说，这个蛋白在体外表达时（e.coli，昆虫和哺乳动物细胞），基本上是不溶，那么是否意味这个蛋白在体内（即病毒合成时）也是不溶的。
如果它是不溶的，或者我们选择的某段起点序列是不溶的，会不会对后续筛选产生影响，也就是说，起点一段不溶序列后面跟随了一段自身可溶的domain，会不会使整个肽段都不溶呢？
如果算结构的文章，那可是天女散花，
1。
2。
3。
体会：随着结构的方法越来越简单，流水线，大规模，routine，一个结构一篇CNS的日子基本已经过去了（除了大complex，和膜蛋白）。
如果你对结构生物学一无所知：
通过这篇文章，你应该知道，结构解析有两个方法
NMR:用于解析比较小的蛋白，小于25kD，比较快速、简单。
复合物，大的蛋白：比较适合用晶体结构、共结晶。
如果你稍微懂一些结构生物学：
通过这篇文章,你可以知道蛋白结构解析的瓶颈是如何得到可溶蛋白，
通过FPLC可以很简单就可以知道两个蛋白是不是相互作用。
如果你比较了解结构生物学：
你只要知道有一种可以得到可溶蛋白的新方法就可以了。
anyway，希望每一个读到这篇文章的人，都可以得到自己的收获。
首先我们来看看这篇文章，是nature structure（全称NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY）上的一篇文章。nature structure 差不多是结构生物学领域最好的一篇杂志，影响因子12左右。
全文应该非常容易找到。
先简要介绍一下这篇文章。
这篇文章的主要内容或者亮点吧
1、提出了一种用于在一个全长蛋白中寻找可溶片段的方法。（ESPRIT）
2、第一次用这种方法得到了禽流感病毒RNA聚合酶亚基PB2中最C端的一个可溶片段。并用NMR方法解析这个这个片段的结构。并且用细胞生物学方法研究了这个片段in
3、用晶体方法得到了这个片段和一个核孔运输蛋白的复合体的结构。
这篇文章所要研究的一个蛋白是禽流感病毒RNA聚合酶中的一个亚基PB2.
RNA聚合酶是禽流感病毒中非常重要的一个蛋白，含有三个亚基PA,
它在病毒的生活史中有两个方面的功能：
1、转录病毒基因组中所编码的蛋白。
2、复制整个病毒基因组。
正因为禽流感危害较大，这个蛋白又非常的重要，所以研究的特别的多，本文所研究的是PB2亚基，大小为759个氨基酸。
目前在世界各地所采集的许多禽流感病毒株中，发现了很多的点突变，这些突变造成的巨大的危害之一就是能够是禽流感病毒，可以更换宿主，或者说能够让它感染哺乳动物，包括人。所以大家都很想弄清除的这些点突变的作用机理是什么。其中有些重要的点突变就是在RNA聚合酶的PB2亚基中。但是这些点突变的机制很难研究，因为到目前为止还没有可用的原子结构。
这是因为:一直得不到可溶的RNA聚合酶的亚基。没有了可溶的蛋白，就无法利用NMR或者X-ray晶体衍射解析其蛋白结构。
因为得到可溶性的蛋白，是蛋白解析结构的前提。无论是NMR还是x-ray都首先需要的到可溶的蛋白。既然PB2的全长无法得到可溶表达，那么很多人都会想到克隆表达全长蛋白中的一个domain或者片段。但是由于目前关于禽流感RNA聚合酶生物信息学的知识非常的匮乏，无法用软件预测PB2全长蛋白中的domain的位置。
怎么办呢？
ESPRIT：翻译过来就是：(通过）随机增加末端切掉片段表达可溶蛋白。
通过名字我们也能猜出这种方法的含义：既然我们不知道全长蛋白中，哪一段单独表达会是可溶的，就只能通过随机的方法来寻找。我们可以从一个全长蛋白的N端或者C端（本文用的是从N端）随机的减掉一个AA，这样把任何一个可能都尝试了，就有可能找到可溶的片段。
PB2全长是759个AA，那么我们从N端一个一个切，那么我们如果得到759个construct就可以包括所有的可能了（C端也同样，但是本文没有做）。
理论上我们可以通过PCR实验，设计不同的引物，应该也可以实现，但是这样无论成本、劳动力都太大了。本篇文章用的就是一个创新的方法。
简单的描述一下：
就是首先将PB2基因查到PGEX中，然后用一种限制性酶切酶从5‘端把Pb2切开，然后用核酸外切酶3来处理，每隔一定时间取样，然后处理成平末端，用T4DNA连接酶重新连接成环，转化到DH5a中，提出痕量质粒转化到BL21中，然后检测可溶表达情况。
这里，我要补充一下，他们检测蛋白是否可溶的方法也比较新颖，通常我们在实验室都是用超声破碎，取全蛋白和上清分别取样跑胶比较而判断的。但是这种方法无法适合大规模的筛选。
本文用的方法，就是通过克隆的方法，在PB2基因的C末端加了14个AA的短肽，这个短肽能够在大肠杆菌体内被生物素修饰，在体外当加入fluorescent
附，文章详细的方法的protocol。
自己总结的。
其实大家不用很详细的看。了解基本原理即可，知道有这么一种方法也就足够。
1
(PCR:pb2+14biotin
2
(Not
3
(transform
4
(nitrocellulose
5
(lysed
6
通过荧光检测就能得到能够可溶表达的片段了。
通过PCR，就很容易知道，可溶表达的片段了，最终的结果找了两个片段：678–759
通过NMR方法就非常容易解析到了这个domain的结构，是一个含有helix和beta-sheet的结构，左图是10个结构，右图是平均结构。
结构生物学的文章，如果想发的比较好，一般有两个条件要满足的，第一，蛋白结构的本身笔记新颖，是一个新的fold。第二，一般都要和功能相互联系，能够用来解析生物现象才最好，通俗的说，结构解析出来之后，还要做一些生物实验或者功能实验。
这个结构DPDE，通过和目前已知的结构库（dali)相比较得知，是一个全新的结构。
另外作者还做了生物学的实验：
1、DPDE的细胞定位。
2、和其他蛋白的相互作用。
通过这些，使得文章的水平非常高。
关于这两个细胞生物学的实验，我会简单的讲，因为我想大家对这个课题本身的兴趣并不是很大，除非你就是研究“禽流感病毒蛋白”的。
首先DPED的细胞定位实验。
通过将DPED和PB2全长和EGFP相连，从而研究比较，他们的细胞定位。
然后将感兴趣的几个部分又做了点突变，并观察对细胞定位的影响。
结论是，他们的细胞定位是一致的，都是细胞核定位，并以此，以及序列比对，提出了一个新的细胞核定位信号：KRx12–15KRxR
第二个生物学实验：研究DPDE和Importin
为了验证他们是不是相互作用，作者用了一个最简单、但是确是最实用的方法，FPLC的方法
图示：
a
b
C
因为在importin的峰里，看到了DPDE的存在，很明显就证明了他们在体外是可以相互作用的。
详细的讲，是：
（您好。我对蛋白质相互作用这块比较感兴趣。但上句是不是应该表述成：
C
因为在importin的峰里，取样做电泳，检测到了DPDE的存在，很明显就证明了他们在体外是可以相互作用的。
多谢指教。）
这个方法的优点：非常简单，结果非常的明了。缺点就是，不太适合两个分子量接近的蛋白。而且，只能看到是否结合，却无法定量，只能定性。
anyway，我们还是可以很多时候考虑用这种方法的。
上面所讲的通过FPLC验证二者可以相互作用，但是这种方法，却无法得知他们是如何相互作用的，也就是说，无法得知，他们确切的相互作用的机理、方式。
于是作者通过共结晶的方法解析了importin
下面是他们的复合体的晶体结构，红色的部分是DPDE的结构。
上面所讲的通过FPLC验证二者可以相互作用，但是这种方法，却无法得知他们是如何相互作用的，也就是说，无法得知，他们确切的相互作用的机理、方式。
于是作者通过共结晶的方法解析了importin
下面是他们的复合体的晶体结构，红色的部分是DPDE的结构。
具体的相互作用方式：
通过分析复合物的结构，找出相互作用的位点，通过点突变，进行验证。
方法还是FPLC。
总结：
之所以将这一篇作为journal
1、他用到了NMR和X-ray这两者解析蛋白结构解析的方法。
2、他告诉我们结构生物学的瓶颈：拿到可溶的蛋白。并提出了一种行之有效的解决方案。
3、他用最典型的方式来阐述了结构如何和功能相联系起来。
4、他用了最简单、直接的方法解决问题：FPLC、点突变、细胞定位。
在这个帖子里，强调的是，世上本无路，走的人多了，也就有了路。不管这路是不是最合适的。
问个问题,我是结构学的外行-.-
随便弄一段可溶片段然后送去分析结构,就可以确定该结构是存在于正常的蛋白质结构中的一部份么?
还是说..这个根本就是结构生物学中的基本常识?
完全不懂了,求教!
一般来说，从来没有“随便”弄一段的说法。
在结构生物学中，像这篇文章中的一个C端的domain，因为从结构上分析，它和前面的区域之间有一个很长的loop，在结构上被认为是形成了一个独立的domain，也许和前面的domain有相互作用，但是事实上，这个domain的独立结构和在整个蛋白中的结构一般认为不会有变化的。
所以在很多文章中，都是拿很多独立的domain作为研究对象：当然不是随便弄一段的呵呵
那就是说还是建立在domain
我没有看原文(比较懒嘿嘿),但是通过看帖子描述,前半部分方法是先快速采样，再确定domain的过程，就是说类似screening,事先其实并不知道哪一段是可溶的;
再次求教，谢谢
ESPRIT：翻译过来就是：(通过）随机增加末端切掉片段表达可溶蛋白。
通过名字我们也能猜出这种方法的含义：既然我们不知道全长蛋白中，哪一段单独表达会是可溶的，就只能通过随机的方法来寻找。我们可以从一个全长蛋白的N端或者C端（本文用的是从N端）随机的减掉一个AA，这样把任何一个可能都尝试了，就有可能找到可溶的片段。
PB2全长是759个AA，那么我们从N端一个一个切，那么我们如果得到759个construct就可以包括所有的可能了（C端也同样，但是本文没有做）。
理论上我们可以通过PCR实验，设计不同的引物，应该也可以实现，但是这样无论成本、劳动力都太大了。本篇文章用的就是一个创新的方法。
简单的描述一下：
就是首先将PB2基因查到PGEX中，然后用一种限制性酶切酶从5‘端把Pb2切开，然后用核酸外切酶3来处理，每隔一定时间取样，然后处理成平末端，用T4DNA连接酶重新连接成环，转化到DH5a中，提出痕量质粒转化到BL21中，然后检测可溶表达情况。
是这个没错吧?
然后是
就这里不太懂,
按之前说的,分析结构一般是以一个独立的domain为单位做NMR和XRAY分析的,这篇文章得到的可溶性片段是直接拿去分析结构了还是先作prediction然后再去分析结构?
如果是直接分析,那如何断定这个片段没有因为'按时间取样'而丧失一定的完整性
如果是后者,那为什么不用传统的方式直接将predicted的domain克隆到vector里去
我真的仔细看了这个帖子了-_-..
可能理解能力有限,还是觉得这个文章有些,奇怪...不好意思
你找到了问题的关键，可能是我没有交代清楚。
你说的很对，通常情况下，我们都是通过预测从而找到domain的。
但是这个蛋白所有的同源蛋白，都没有解析出来结构，所以我们无法predict出来哪里可以形成独立的domain，而只能像这篇文章用的方法，把所有的可能的片段都找出来，然后看看哪些片段可以形成独立折叠的domain。
predict的基础是同源蛋白已经有了结构才可以。
但是对于没有同源结构的，只能用本文的方法了，虽然成本很高呵呵
看完之后，有一个问题
他用的方法确实很新颖，用外切核酸酶来获得从C端开始的全部长度的基因片段，虽然他也可以用类似的方法来获得从N端开始的全部片段，
但是，这样获得的片段都有一个固定的起点，要么C端，要么N端
那么，如何获得在基因内部的某段序列，并且筛选它是否是具有某种结构的domain呢？
我想，能不能参考它的方法继续进行下去，现在他已经确定了C端的一个可溶性domain和一个loop，那么，我们可以用loop上的某个aa作为新的C端起点，用同样的方法进行筛选，那么会不会得到下一个可溶性domain呢？再以这个domain的终点aa作为下一次筛选的起点，从而完成对全序列的筛选？当然，我们也可以同时从N端开始筛选，从两边向中间靠拢，这样速度会更快。
另外，我还有一个问题，（我不是学结构，可能比较弱）
文章说，这个蛋白在体外表达时（e.coli，昆虫和哺乳动物细胞），基本上是不溶，那么是否意味这个蛋白在体内（即病毒合成时）也是不溶的。
如果它是不溶的，或者我们选择的某段起点序列是不溶的，会不会对后续筛选产生影响，也就是说，起点一段不溶序列后面跟随了一段自身可溶的domain，会不会使整个肽段都不溶呢？
如果算结构的文章，那可是天女散花，
1。
2。
3。
体会：随着结构的方法越来越简单，流水线，大规模，routine，一个结构一篇CNS的日子基本已经过去了（除了大complex，和膜蛋白）。