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[转载]IP实验 - CLIP-seq(紫外交联免疫沉淀结合高

2019-01-08 14:45阅读:

达鹊生物实验外包服务内容:CLIP-seq(紫外交联免疫沉淀结合高通量测序)
应用范围:RNA结合蛋白作用机制研究、lncRNA/circRNA功能机制研究、miRNA靶标鉴定


CLIP-seq概念:
其主要原理是基于RNA分子与RNA结合蛋白在紫外照射下发生耦联,以RNA结合蛋白的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体沉淀之后,回收其中的RNA片段,经添加接头、RT-PCR等步骤,对这些分子进行高通量测序,再经生物信息学的分析和处理、总结,挖掘出其特定规律,从而深入揭示RNA结合蛋白与RNA分子的调控作用及其对生命的意义。


技术优势:
准确性高: 从活细胞交联开始,反应了体内环境下真实的分子间相互作用。
特异性强: 紫外辐射不会造成蛋白和蛋白之间的交联,只会鉴定出蛋白和 RNA 之间的相互作用。
应用范围广: 特别适用于研究剪接因子RNA结合图谱、miRNA作用靶点等研究。


实验流程
1、3'adaptor连接
2、5'adaptor连接
3、第一链cDNA合成
4、PCR扩增


5、片段大小选择
6、文库质检
7、Hiseq 2500高通量测序

8、生物信息分析


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测序模式:


HiSeq 2500单端1X50bp测序模式


20M clean reads



标准数据分析
1、去除接头序列及低质量reads的处理
2、测序质量评估
3、序列比对
4、测序reads全转录组分布图
5、结合峰鉴定
6、结合峰基因元件分布
7、差异结合峰检测
8、差异结合峰相关基因GO功能富集分析
9、差异结合峰相关基因KEGG生物通路富集分析
10、个性化数据分析
11、结合峰的motif检测



案例解读一:
研究者采用了CLIP-Seq方法全面获得hnRNP U基因组范围内的结合图谱,发现hnRNP U不直接结合SMN2上关键的7号外显子及周围intron区域,却直接结合U2 snRNA的SmBP-box区域。因此,hnRNP U可能通过参与U2 snRNP 的相互结合而被招募到组成型 3' 剪接位点的附近,与U2AF65相互作用。
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案例解读二:
Argonaute 蛋白(Ago1和Ago2)是miRNA沉默效应蛋白复合物(miRNPs)的组成部分。本研究通过RIP-Seq技术,对人结肠癌细胞系在正常状态和低氧条件下Ago1 和Ago2蛋白共沉淀的miRNA 和mRNA关联体进行进行差异分析和功能注释。通过对比发现结合Ago1和Ago2的miRNA共享度较高,而mRNA功能存在明显差异。


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microRNAs表达分析
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