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利玛窦以黄金五百两买下其住地旁的“苜善书院”（原为明东林讲学之所），将其作为私人祈祷所，当时规模很小，随着信教人数的不断增加，1605年，利玛窦神父将其改建成一座小教堂，当时有奉教者200多人。
教堂竣工后，汤若望立碑记其事，因汤若望的博学和友善，清顺治帝曾24次到南堂微服私访，并与汤若望促膝谈心，还亲切地尊称59岁的汤若望神父为“玛法”（玛法是满语“父亲”的意思），汤若望历任满清两朝官吏，官至二品钦天监监正
1666年，汤若望神父去世，继之而来的是比利时耶稣会士南怀仁，1675年，康熙帝两次亲临南堂看望南怀仁。1690年，天主教成立北京教区，认命意大利籍伊大仁为主教，南堂作为主教府，此后南堂曾两次遭地震破坏，1703年，康熙帝赐银十万两重新修建，1900年，南堂毁于义和团，1904年又重修增高，扩大至今天的规模
注：东堂（若瑟堂）、南堂（圣母无原罪堂）、西堂（七苦圣母堂）、北堂（救世主堂）并称北京四大天主堂。