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CoIP的结果解读

2018-12-27 12:12阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/1575035940

最近读了一篇文献，里面使用了一些CoIP实验，搜索了相关资料，以及向实验室做蛋白相互作用的高手求教了之后，总结了CoIP的笔记。


文献信息如下：
Abe, T., et al. (2017). 'Germ-Cell-Specific Inflammasome Component NLRP14 Negatively Regulates Cytosolic Nucleic Acid Sensing to Promote Fertilization.' Immunity 46(4): 621-634.


CoIP的原理图，如下所示：
CoIP的结果解读

文献中CoIP的实验截图：


CoIP的结果解读


先看一下图中的缩写：
IP全称是immunoprecipitation，即免疫沉淀，这一步主要是为了纯化目的蛋白。
IB全称是immunoblotting，即免疫印迹，也就是常规的Western Blotting，用于显示目的蛋白。
WCL全称是whole cell lysates，即整个细胞的裂解成分。
HC全称是heavy chain，即重链，
LC全称是light chain，即轻链。


现在将图分为三部分，先看第一部分，即上面的部分，“+”表示含有这种蛋白，“-”表示没有，这个实验一共做了四组，从左到右分别为：只表达HA-cGAS的293T细胞；共同表达HA-cGAS与NRLP14-FL的293T细胞；只表达STING-HA的293T细胞；共同表达STING-HA与与NRLP14-FL的293T细胞，如下所示：
CoIP的结果解读
再看第二部分WB的图，WB的图就是使用含有FLAG抗体的珠子拉下来的蛋白做的，使用拉下来的这些蛋白再做WB，它的原理前面已经描述过了。使用FLAG抗体的珠子拉下来的蛋白使用HA抗体来进行检测，其结果如下：
CoIP的结果解读
从上面的图像可以看出以下信息：
第一，HC与LC条带都非常明显，之所以出现这个条件是因为，在WB之前进行的蛋白变性这一步，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇，巯基乙醇会把抗体的重链和轻链之间的二硫键破坏，从而使的抗体变成重链分子55KD和轻链分子25KD，因此会在结果中呈现两个条带。
第二，第组（只表达HA-cGAS的293T细胞）中没有条带，第组（共同表达HA-cGAS与NRLP14-FL的293T细胞）没有条带，第组（只表达STING-HA的293T细胞）有一点点条带，第组（共同表达STING-HA与与NRLP14-FL的293T细胞）条带明显，这说明NLRP14与STING有相互作用，为什么说有相互作用呢？因为我们是用FLAG抗体来拉的蛋白，从理论上讲，我们只能拉下FLAG标记的NLRP14，也就是NLRP14-FL（FL就是FLAG），但是，从拉下的蛋白中用HA进行检测，居然检测出来了HA标记的STING，这就说明，使用FLAG拉NLRP14-FL时，这个蛋白复合物中含有STING-HA。
再看图的第三部分，也就是下面的这一部分，是用FLAG抗体和HA抗体来进行检测整个细胞的裂解液，是作为阳性对照（有的文献中会标明input组），如下所示：
CoIP的结果解读
其中右侧的WCL表示的是整个细胞的裂解液，也就是还没有使用FLAG抗体的珠子去拉的时候的样本，也就是说直接裂解了293T细胞后的样本，从这个结果中可以得到以下信息：
第一，在使用FLAG抗体进行检测全蛋白时，相当于阳性对照。第组（只表达HA-cGAS的293T细胞）中没有条带，因为这种293T细胞中只有HA标记的cGAS，第组（共同表达HA-cGAS与NLRP14-FL的293T细胞）有条带，因为FLAG抗体能检测出使用了FLAG标记的NLRP14，NLRP14的蛋白分子量大概是125kD，第组（只表达STING-HA的293T细胞）没有条带，因此这种293T细胞只表达HA标记的STING；第组（共同表达STING-HA与与NLRP14-FL的293T细胞）条带明显，因为这个细胞中含有FLAG标记的NLRP14。
第二，使用HA抗体检测全蛋白，这是阳性对照，是说明细胞中含有相应的蛋白。我们可以发现，第一组（只表达HA-cGAS的293T细胞）在27kD附近没有条件，在50kD部分有条带，这说明，全蛋白中含有HA标记的cGAS（cGAS的蛋白分子量是62kD，多数蛋白标签的分子量很少，基本可以忽略），做这个实验主要是作为阳性对照；第二组（共同表达HA-cGAS与NLRP14-FL的293T细胞）在37kD附近没有条带，在50kD附近有条带；结合前面的结果来看，就说明这个细胞中含有HA标记的cGAS（因为它的分子量大概是50kD），还含有FALG标记的NLRP14（因为NLRP14的蛋白分子量大概是125kD）；第三组（只表达STING-HA的293T细胞）在37kD处有条带，这说明细胞中含有HA标记的STING（因为STING的分子量大概是35kD）；第四组（共同表达STING-HA与与NLRP14-FL的293T细胞）在110kD处有条带，在37kD处也有条带，这说明这种细胞中含有NLRP14与STING。
从上面的图片可以知道，在做Co-IP实验时。需要设立阳性对照组来证明你的细胞中有某个蛋白A与B，再使用抗蛋白A的抗体来拉A蛋白，再使用抗蛋白B的抗体来检测拉下来的蛋白，如果检测到了蛋白B，就说明蛋白A与蛋白B有相互作用。

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