酸奶中嗜热链球菌的分离及鉴定

2010-12-23 10:15阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/1576203102

酸奶是经乳酸菌发酵的乳类，是一种人们非常喜爱的发酵食品。具有维持肠道菌群平衡、增加免疫功能、降低血浆和肝脏的胆固醇含量、抗肿瘤、延缓机体衰老等保健作用。黑龙江省牡丹江市生产的“ 三道” 牌酸奶所用的乳酸菌种为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，在普通细菌培养基上菌落生长较小，不易被观察到，分离具有一定的困难。本实验建立了实验室快速分离和鉴定嗜热链球菌的方法。
1. 材料与方法
1.1分离培养基
BCG牛乳培养基 ：
( A) 溶液：脱脂乳粉2 0 g，水1000mI，加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.2mL 80℃灭菌 20min
( B ) 溶液：酵母膏 2g，水100mI，琼脂 4g，121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将( A) ( B ) 溶液混合均匀后倒 8个平板。

乳酸菌葡萄糖发酵培养基 蛋白胨0.5g，牛肉膏0.5g，酵母膏0.5g，吐温 8 0 0.05ml，葡萄糖1g，蒸馏水100ml，加入1.6%溴甲酚紫溶液约0.14ml。以上成分溶解后调pH到 6.8 ～7.0分装到10只试管中。每只试管里再放置一支德拉姆氏小管。105℃湿热灭菌 15min。
牛乳培养基 12g全脂奶粉，加水100mL加入10g 葡萄糖，溶解后分装，105℃灭菌15min，取出备用。
1.2实验方法
嗜热链球菌分离与纯化 将新鲜酸奶采用稀释平板涂布法进行平板涂布分离。挑取培养基上的黄色菌落( 菌落周围培养基

变为黄色)，采用划线法进行分离纯化，获得纯菌种。
菌种的革兰氏染色和形态观察 将分离的纯菌种接种在BCG牛乳培养基上，40℃培养28h，用无菌接种环取一环菌均匀涂布在滴有无菌水的载玻片上，自然风干。固定后进行革兰氏染色。染色后用显微镜油镜进行观察。
发酵产物鉴定——纸层析法 将分离的纯菌种接种到乳酸菌葡萄糖发酵培养基上， 40℃培养48h。取产酸不产气的液体试管中发酵液做纸层析。展开剂：水30mL、苯甲醇150mL、正丁醇150mL、甲酸3.3mL。显色剂：将1.6%的溴酚蓝酒精溶液用0.1 mol／L的 NaOH 调pH到6.7。显色后，分别测定发酵液与2%标准乳酸的Rf值，确定发酵产物中是否有乳酸。
牛奶发酵实验 将分离的纯菌种活化后，以2%的接种量接入牛乳培养基中，摇匀后，将瓶盖拧紧密封。将三角瓶置于40℃恒温箱中培养，出现凝固后转入4℃冰箱中冷藏24h。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌分离与纯化的结果
酸奶稀释涂布平板培养48 h后，在 BCG牛乳培养基上有很多黄色菌落，菌落周围培养基变为黄色，此即为嗜热链球菌疑似菌落。菌落特征为：黄色、扁平、边缘不整齐、菌落平均大小为1.37mm。取具有上述特征的菌落进行进一步划线分离，最终获得纯化菌株，编号为M₁。
2.2 M₁的革兰氏染色结果及形态观察
M₁菌体革兰氏染色为蓝紫色，革兰氏阳性。菌体球形或卵圆形，排列成对或形成长短不等的链状。
2.3发酵产物纸层析实验结果
将M₁接种到乳酸菌葡萄糖发酵培养基，40℃培养48h后，培养基由紫色变成黄色，德拉姆氏小管不产气，取产酸不产气的液体发酵液点样做纸层析。同时点样空白发酵液和2% 乳酸做对照。实验结果见表 1 ．
表 1 M₁ 菌株葡萄糖发酵液纸层析实验结果

点样项目	基线到显色圈中心距离（cm）	基线到溶剂前沿距离（cm）	Rf
M1菌株葡萄糖发酵液	18.1	——	0.69
空白发酵液	——	26.4	——

由表 1可知，M₁菌株葡萄糖发酵液迁移率 Rf =0.69，2%标准乳酸迁移率 R f=0.69，二者迁移率一致，说明发酵产物中有乳酸。结合革兰氏染色及菌体形态观察结果，确定M₁菌株为嗜热乳酸链球菌。
2.4 M₁菌株牛奶发酵结果
将活化的M₁菌株接入灭菌的牛乳培养基中进行牛奶发酵，冷藏24h后进行风味品评，实验结果见表 2 ．
表 2 嗜热乳酸链球菌发酵的酸奶品评结果

接种菌株	凝乳时间	凝乳情况	口感和香味	异味	pH值
M₁	4.6h	凝乳均匀，少量乳清析出	较好、脂香味浓	无	5.2

由实验结果可知，M₁菌株的凝乳时间较短，酸奶具有较好的口感和特有的脂香味，但其酸味不足。在实际生产中，嗜热乳酸链球菌的主要作用是生成脂香味物质，该菌株具有良好的产生脂香味物质的能力，可以和保加利亚乳杆菌混合发酵生产酸奶．
3 结论
( 1 ) 利用BCG牛乳培养基为分离培养基，采用涂布稀释分离的方法，从酸奶中成功分离出嗜热乳酸链球菌。因在BCG牛乳培养基中有溴甲酚紫( 一种酸碱指示剂) ，因而其在BCG牛乳培养基上的菌落颜色为黄色，很容易与不产酸的杂菌分开，提高了分离效率。利用该方法分离嗜热链球菌，菌落较大、菌落容易观察，极大地提高了分离效率．
( 2 ) 采用常规的革兰氏染色、形态观察和发酵产物纸层析实验相结合的方法对分离到的菌株进行简单鉴定，该方法操作简单、快速、实验结果可靠．
( 3 ) 分离到的嗜热乳酸链球菌菌株经活化后可以应用到生产中．
了解更多培养基及微生物相关信息www.hopebiol.com

举报/Report

我的更多文章

下载客户端阅读体验更佳