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细菌鞭毛染色法---镀银染色

2011-11-01 14:47阅读:
镀银染色法:1958Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染色法,建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。试剂分为媒染剂和银染剂。媒染液:10%单宁酸10 ml5 ml饱和硫酸钾铝水溶液,再加1 ml苯胺饱和水溶液形成沉淀,通过摇动又能重新溶解,加入5�Cl3水溶液1 ml形成黑色溶液,稳定10 min后使用。银染液:配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml备用,再缓慢加入浓氨水(比重0.880)使形成的沉淀刚好重新溶解,最后把备用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入,直到摇动后呈现轻微而稳定的薄雾状溶液为止,避光保存,可稳定数周。用媒染液染片3
5min,蒸馏水充分洗涤后,再把银染液滴加至涂片上。加热至接近沸腾,染色35min。由于Rhodes镀银染色法媒染液成分复杂、操作繁锁,所以1965Blenden等改良了细菌鞭毛镀银染色法的配方。试剂A100 ml蒸馏水中加入 5 g单宁酸,1.5 gFeCl315%福尔马林2 ml1%NaOH溶液1 ml。试剂B:使用2% AgNo3,其他同于Rhodes,但试剂不稳定,要求在4h内使用,并用要用氨水调pH10。试剂A染片24min,试剂B染色30 s,不需加热。由于以上两种镀银染色方法都要使用营养琼脂斜面培养物,并且需用无菌蒸馏水悬浮菌液制片,未采用评分法评价镀银染色方法。因此1977年,West等对镀银染色法进一步改良,制备涂片时直接使用血平板,评价染色效果首次使用5分制,通过该评价方法证明了加热银染液染片可以提高染色效果。试剂配方:媒染液为饱和硫酸钾铝水溶液25 ml10%单宁酸50 ml5�Cl3水溶液5 ml5℃保存,染色液配制同Rhodes,但需避光5℃保存。媒染液染片4min,银染液滴加至涂片上加热至微冒蒸汽,染色4min。同时West等还对使用不同培养基进行染色效果评价,包括半固体动力培养基、血琼脂平板TSAtrypticase soy agar)斜面,其中半固体动力培养基和TSA斜面25℃,培养1824h;血琼脂平板3537℃,培养1824h。评价结果血琼脂平板3537℃,培养1824h不适于细菌鞭毛染色,而半固体动力培养基和TSA斜面25℃,培养1824h适合于细菌鞭毛染色,同时也证明了使用福尔马林处理标本制备涂片并不能有效阻止鞭毛脱落。由于镀银染色法媒染液不稳定,需避光5℃保存,1992Porter等继续改良该方法,其试剂配方同West等的方法,只是媒染剂避光室温可保存数月,延长媒染剂染色时间为8 min,染色液不需加热,只染30 s,制备涂片程序略有不同。使用TSA平板,36℃培养24h,但遗憾的是Porter等只使用了1种细菌(奇异变形杆菌)进行研究。于是1994Finegan等进一步证实使用过期媒染剂进行镀银染色可以增强鞭毛染色效果,并使用4种细菌(绿脓假单胞、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、枯草芽孢杆菌),用trypitcase soy肉汤及其琼脂平板,26℃培养24h。试剂配方仍不变,媒染液放置124816周后进行染色,媒染液染色8 min,银染液染色3060 s,不需加热。这4种细菌均染色成功,从而证明媒染液可至少放置16周。

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