毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用
2009-02-26 16:12阅读：
毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用
中国生物工程杂志China Biotechnology, 2006, 26(1):87～91
张伍魁*范清林宋礼华
（安徽医科大学基础医学院合肥230032）
摘要巴斯得毕赤酵母（Pichia
pastoris）表达系统作为一个日臻完善的外源蛋白真核表达系统由于它所具有的一些其它表达系统不可比拟的优势而得到越来越广泛的应用。分别从该表达系统的优点、外源基因整合及调控机理、表达蛋白糖基化及翻译后修饰等方面综述了其在外源蛋白表达中的研究进展及应用。
关键词巴斯得毕赤酵母外源基因糖基化
中图分类号Q786
巴斯得毕赤酵母（Pichia
pastoris）表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统［1］，它既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等。同时它还避免了酿酒酵母（Saccharomyces
cerevisiae）分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷［2］。除此之外，由于它在蛋白质表达方面还具有以下几个其它表达系统所不可比拟的优点而使得该系统成为目前研究最多、应用最广泛的真核表达系统之一：(1)它所具有的aox启动子是一种强有力的启动子，受甲醇严格诱导调控而表达，所以可严格调控外源蛋白的表达；(2)由于它可以对表达蛋白进行糖基化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、脂类酰化等一系列的翻译后修饰，从而使其表达的蛋白具有生物活性；(3)表达量高，迄今为止，已有300多种异源蛋白在该表达系统中获得了高效表达，如破伤风毒素片段C可达12g/L［3］，而明胶的表达量甚至达到了14.8g/L［4］，已有报道其胞内表达量惊人，甚至达到了22g/L；(4)外源基因的表达产物既可存在于胞内，又可通过其特有的信号肽α因子或天然蛋白本身的信号肽分泌至细胞外，同时，该系统自身分泌的蛋白非常少，这大大简化了纯化过程，如表达的重组水蛭素（HIR
），仅经过二步层析纯化就可达到97％以上的纯度；(5)整合入外源基因的重组子表达系统十分稳定。有文献报道通过同源重组整合入外源基因的重组子表达系统可连续培养50代却未见外源基因丢失的现象［5］；(6)糖基化程度低，毕赤酵母中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为8~14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50~150甘露糖残基要短得多［6］，同时，由于毕赤酵母不能象酿酒酵母那样在核心多糖末端形成α1,3末端甘露糖，使得它的蛋白抗原性远远低于后者。因而更适合于治疗用途［7］；(7)该表达系统由于对营养要求低，培养基成份简单廉价，可进行高密度高产量的发酵培养，便于工业化生产。
1常用表达菌株及表达载体1.1表达菌株
P.pastoris作为一种甲醇利用型酵母菌，自1969年开发以来，通过数十年的研究，至今已有多个种属被开发出来，新近发展起来的嗜甲醇酵母包括Candida和Pichia
2个种属，共有30余种［8］，其中尤以P.pastoris发展最快，研究最清楚。目前，用于外源基因表达的P.pastoris菌株为Invitrogen公司构建，主要有：Y11430，MG1003，GS115，KM71和SMD1168，其中Y11430为野生型，其余皆为组氨酸突变型，GS115有完整的aox1基因，在甲醇培养基上表型为Mut+，当用重组表达载体转化后，由于表达载体线化所用酶不同，其转化子表型可能是Mut+或Muts，可通过MD和MM培养基进行表型的鉴定；KM71的aox1基因被ARG4基因替代，虽然aox2和aox1有97％同源性，但aox2利用甲醇的能力远比aox1弱［9］，在甲醇培养基上表现为Muts，其转化子也是Muts，表型不必鉴定。SMD1168为蛋白酶缺陷型菌株，特别适用于分泌表达载体，可避免表达外源蛋白被宿主菌同时表达的蛋白酶所降解，其它蛋白酶缺陷型主要还有SMD1165和SMD1163［10］。MC1003的aox基因全部删除，不能利用甲醇，即表型为Mut－His－。
1.2表达载体
P.pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体，目前常用的表达载体多是美国Invitrogen公司开发构建的。P.pastoris既有分泌表达型的，又有胞内表达型的。常用的表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHILS，pAO815，pHILD2和pPICz等，其中pPIC9，pPIC9K和pHILS为分泌型表达载体，而pAO815，pHILD2和pPICz为胞内型表达载体，不同载体除具有各自特殊的基因组件外，还具有一些共同的序列，如这些载体都包括一个表达盒（cassette）和一个多克隆位点。表达盒由900bp的5′aox1序列和约300bp的3′转录终止序列组成［9］，用特异的酶切割多克隆位点可以使目的基因插入到相应的酶切位点中。多数P.pastoris表达载体还含有HIS4基因，它可以作为转化体的选择标记，同时还含有在细菌中复制所必须的序列及一些选择标记，如大肠埃希氏菌的复制起始点和Amp抗性基因等；还有一些载体含有来自于aox1基因的3′端侧翼序列，它可以用来指导含外源基因的组件插入3′aox1基因位点或以基因整合的方式整合到酵母染色体的aox1位点［11］。
一般情况下，整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多，蛋白表达量就越高。多拷贝发生在aox1或组氨酸基因位点，但同一位点同时插入多个基因的几率仅占His+转化体的1%~10％，为此，人们根据不同表达载体的组成特点，如pPIC3K，pPIC9K含有kanr抗性基因；pPICz系列含有bler基因，利用基因剂量效应，分别依靠G418R或ZeocinR的抗性水平来快速筛选除高拷贝的整合转化子。对于PAO815，一般通过多拷贝表达盒BamHIBglII串联而先在体外用人工方法构建好多拷贝载体，然后转化到宿主菌中获得多拷贝转化子［12］。
2006, 26(1)张伍魁 等： 毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.26 No.1 2006
2基因整合及表达调控的机理2．1基因整合
像酿酒酵母一样，表达载体通过酶切线性化之后，可与P.pastoris基因组的同源序列发生同源重组而产生稳定的重组转化子［13］。目前，把载体线性化的DNA转入到宿主菌主要有4种方法，即电穿孔法、原生质体法、PEG法和锂盐法。其中原生质体法和电穿孔法转化效率最高，且有时可得到含多拷贝外源基因的转化子，有报道称电穿孔法的转化效率可高达105/μg。同时由于电穿孔法简便、快捷、高效，故是目前最理想的转化P.pastoris的方法。P.pastoris重组可分两种情况：一种是单交换，即在HIS或5′aox的单酶切位点将质粒载体线性化，通过单交换（插入）整合入染色体，这样由于aox1基因仍然保留，所得到的转化子表型为Mut+；另一种为双交换（或替换），即外源基因通过重组替换了染色体上的aox1基因，从而造成aox1的缺失，得到的转化子为Muts。
2．2调控机制
P.pastoris的调控主要是在转录水平对醇氧化酶基因（aox）进行调控。毕赤酵母是一种甲醇利用型酵母菌，甲醇作为唯一碳源时，可在醇氧化酶的作用下，被氧化成过氧化氢和甲醛。在毕赤酵母中有2个醇氧化酶基因：aox1和aox2。aox1可受甲醇专一诱导而高水平表达；aox2虽然在序列上与aox1的同源性达97％及以上且表达的蛋白具有相似的生物学活性，但aox1的表达水平却明显高于aox2，即aox1的启动能力强于aox2［14］，故细胞中乙醇氧化酶的活力主要由aox1提供，当以甲醇为唯一碳源时，aox1基因的表达可被甲醇严格调控，使得外源基因可严格保持在“表达（有甲醇）－不表达（无甲醇）”的模式。aox1的表达可被诱导到相当高的水平，可占整个细胞可溶蛋白的30％以上。当aox1基因缺失时，aox2表达水平很低，乙醇氧化酶活力极大丧失，细胞利用甲醇能力极大降低。aox1基因主要受诱导和抑制机制调控：当以甘油或葡萄糖为碳源时，aox1的转录被抑制，而在以甲醇为唯一生长碳源时，aox1被诱导转录并表达。最近在P.pastoris中克隆到一个组成型启动子PGAP，即三磷酸甘油醛脱氢酶启动子，在它的控制下，βLacz基因的表达水平比甲醇诱导下的aox1的表达量更高［15］，同时，由于该组成型启动子不需要甲醇诱导，更适合于医药生产，被认为是一个很有潜力的启动子。
3外源基因自身特性对P.pastoris表达系统的影响不同的外源基因在P.pastoris的表达水平相差可达上千至几千倍，如明胶的表达量可达到14.8g/L，而鼠Scrotonin受体的表达量仅为0.001g/L，HIV表面糖蛋白甚至不能表达［16］。这主要是由外源基因自身的特性所决定的。外源基因主要在以下几个方面影响P.pastoris对其自身的高效表达：(1)有些A+T含量高的基因在P.pastoris表达时会造成转录的提前终止,其共有序列ATTATTTATAAA就是一个典型的转录终止信号同时A+T含量高的序列中还可能存在一些不太确定的转录终止信号,故对A+T含量丰富的基因最好是重新设计序列，使A+T含量控制在一个理想的理论范围之内。
(2)外源基因序列中的mRNA
5′端非编码区(5′UTR)的核苷酸序列和长度是影响外源基因能否高效表达的又一重要因素,适当长度的5′UTR可极大地促进mRNA的有效翻译。5′UTR太长或太短都会造成核糖体40S亚单位识别的障碍。aox1基因的5′UTR长为114bp并富含A+U时,其编码的乙醇氧化酶表达量极高,这提示我们使外源mRNA的5′UTR尽可能和aox1
mRNA的5′UTR相似是必需的，有报道这种方法可使人的血清白蛋白(HSA)的表达量提高50倍之多［17］。(3)酵母菌对外源基因的表达还和外源基因的密码子的选用有关,有些表达系统的宿主在密码子的使用上具有明显的偏爱性，在酵母中表达量较高的基因往往采用的都是酵母所偏爱的密码子，在所有的61个密码子中,有19~25个是酵母所偏爱的密码子，高表达的基因几乎毫无例外地使用这25个偏爱的密码子［18,19］。目前，一般通过截取基因中影响其生物活性的部分或进行同义点突变以高利用率的密码子替代同义的低利用率密码子的方法来提高外源基因的表达水平，如P.pastoris表达植酸酶时,把酵母使用频率低的精氨酸密码子突变为使用频率较高的密码子，可使表达量提高37倍［20］。(4)外源基因的拷贝数也是影响其能否在P.pastoris高效表达的一个重要因素。虽然许多实例表明含单拷贝外源基因表达框的宿主菌有时足以获得最佳产量,但在大多数情况下,随着拷贝数的增加外源蛋白的表达量也会相应增加，如重组鼠表皮生长因子(mEGF)在P.pastoris中的表达量与其含外源基因拷贝数成正相关。但也有研究发现，有些基因的高拷贝反而会降低其表达水平，推测可能是分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制所引起的。因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的，高表达菌株的筛选只应以表达蛋白量的高低为唯一标准。
另外，表达条件(如培养基、通气量、菌株及载体的选择等)及所表达外源蛋白的特性也都会影响外源基因在P.pastoris中的高效表达。
4P.pastoris表达产物的糖基化4．1N和O糖基化
P.pastoris能对表达的蛋白进行N和O糖基化，其中由于N糖基化发生较多且其对许多蛋白质的折叠、药物动力学的稳定性及功能是必需的，故对其研究也相对较为深入。当蛋白质含有一致性序列AsnXaaThr/Ser（Xaa代表任何氨基酸）时，P.pastoris能对其中天冬氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，即产生N糖基化。若对蛋白质中的苏氨酸/丝氨酸上的羟基进行糖基化即产生O糖基化。P.pastoris的糖基化程度比酿酒酵母小但比哺乳动物大［21］。P.pastoris的N、O糖基化作用从内质网开始，在高尔基复合体中进一步加工修饰。研究表明O糖基化对蛋白质形成正确的空间结构至关重要［22］，可能由于到目前为止检测到的大多数糖蛋白中O多糖比例极少，故与N糖基化相比其研究也较少。虽然P.pastoris表达蛋白的糖基化过程与酿酒酵母十分相似，但二者也存在着差异：首先，前者表达蛋白每个侧链的平均长度（8~14个甘露糖残基）比后者（50~150个甘露糖残基）要短得多，这可能使得前者对表达蛋白质性质的影响较后者要小得多。此外，P.pastoris不能在寡聚糖链添加α1,3末端甘露糖,而酿酒酵母则很容易形成α1,3末端甘露糖,该形式连接的多糖被认为是酿酒酵母表达的蛋白质具有抗原性的原因之一。到目前为止,对P.pastoris寡聚糖侧链结构了解还很少,也不清楚为什么一些P.pastoris分泌蛋白会添加侧链和如何形成侧链,这些问题仍待进一步研究探索。
4.2糖基化对蛋白质产量及功能的影响
糖基化对P.pastoris表达蛋白质产量的影响因蛋白不同而异，既有糖基化会提高或降低表达产量的报道，也有糖基化对蛋白质表达量无明显影响的报道。造成这种影响的原因目前尚不明确。同样,糖基化对P.pastoris表达蛋白功能的影响也因蛋白的不同会造成三种情况：即增强功能、降低功能和对蛋白功能无明显影响，这可能与蛋白糖基化位点所处的部位有关［23］。与酿酒酵母相比，P.pastoris表达蛋白的糖基化程度虽然有所减轻，但与天然蛋白相比，仍可能存在过度糖基化的问题。过度糖基化不仅会影响蛋白质的合成和分泌及改变蛋白质的活性，同时也对进一步的蛋白质纯化不利。目前主要通过以下几种方法来尽量避免蛋白过度糖基化的问题：(1)基因定向突变去除糖基化位点；(2)将目的蛋白与糖苷酶共表达；(3)改变培养基成分。
5外源蛋白的翻译后修饰P.pastoris作为真核生物，可以进行类似哺乳动物细胞的许多翻译后修饰，包括二硫键的形成、信号肽序列的加工、折叠、糖基化及脂类酰化等［24］。目前研究最多的是糖基化作用，蛋白质的糖基化链在细胞识别、指导蛋白质的正确折叠、激素与受体的结合、蛋白质定位等方面都具有重要作用。同时，糖基化还具有组织和细胞特异性。
外源蛋白在P.pastoris中的分泌表达需信号肽的引导。常用的分泌信号既有属于酵母自身的αMF与PHOI，也有外源蛋白自带的天然分泌信号，如PHAE。外源蛋白的天然分泌信号常不能被酵母表达系统完全利用，故现在多采用酵母自身的信号肽［25］。蛋白质在分泌的过程中，还可以通过形成二硫键进行折叠或构成双体，或通过切除部分肽段成熟。
6应用前景及展望P.pastoris作为一种异源蛋白表达系统，它既有原核生物分子遗传操作简便、培养成本低、产量高、产物便于分离纯化等优点，又具有大多数真核生物共有的翻译后修饰机制。因此该表达系统从一被开发就逐渐显示出其在表达外源蛋白方面的独特优势。近年来，用该表达系统成功表达的蛋白达到了300多种，表达的蛋白主要包括基因工程疫苗，如乙肝疫苗及一些来自动植物和细菌的各种酶、膜受体蛋白、抗原和抗体及一些用来研究晶体结构的蛋白等。同时，该系统作为一种基础研究的模型系统在分子生物学领域也发挥了越来越重要的作用，如用该系统进行过氧化物酶体的输入和组装及真核细胞的分泌途径和功能等方面的研究。目前国内也有多种蛋白在该系统中获得了高效表达，如人白蛋白、人胰岛素、干扰素、乙肝表面抗原、集落刺激因子等几十种蛋白质。但该表达系统仍存在一些缺陷，如过度糖基化、表达周期过长及一些外源蛋白难以在该系统获得有效表达等。相信随着人们对它的利用和研究的不断深入，必将增添新的见解，并最终解决这些困难，使得该系统日臻完善，那时将会有越来越多的蛋白可以在该系统中获得高效表达，它也必将在分子生物学及工业应用的各个领域发挥更大的作用。
参考文献
［1］ Siegei R S. Methylotroyphic yeast Pichia pastour produced in
highcelldensity fermentation with high cell yields as
vehicle for recombinant protein production.Biotechnology and
Bioegineering,1989,34:403~404
［2］ 王谨，李天增，才学鹏.甲醇酵母表达外源基因的研究近况中国兽医科技，2003,33(7)：34~38
Wang J, Li T Z, Cai X P. Chinese Journal of Veterinary Science and
Technology, 2003,33(7):34~38
［3］ Clare J J, Rayment F B, Ballantine S P, et al. Highlevel
expression of tetanus toxin fragment C in Pichia pasteris strains
containing multiple tandem integrations of the gene. Biotechnology,
1991,9(5): 445~460
［4］ Marc W T. Highyield secretion of recombinant gelation by
Pichia pastoris. Yeast, 1999,15: 1087~1096
［5］ 周则迅，袁汉英，何炜. 乙肝病毒表面抗原SA28融合基因在酵母中的组成型表达.
复旦学报（自然科学版），2000，39（3）：264~268
Zhou Z X , Yuan H Y, He W. Journal of Fudan University(Natural
Science), 2000,39(3):264~268
［6］ Choi B K, Bobrowicz P, Davidson R C, et al. Use of
combinatorial genetic libraries to humanize Nlinked glycosylation
in the yeast Pichia pastoris. Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:
5022~5027
［7］ Scorer C A, Buckholz R G, Clare J J, et al.The intracellular
production and secretion of HIV1 envelope protein in the
methylotrophic yeast Pichia pastoris. Gene, 1993, 136:
111~119
［8］ Cereghine J L, Cregg J M. Heterologous protein expression in
the methylotrophic yeast Pichia pastoris.FEMS Microbiol Rev,2000,
24(1):45~66
［9］ Koutz P J, Davis G R, Stillman C, et al. Structural comparison
of the Pichia pastoris alcohol oxidase genes. Yeast, 1989,5(3):
167~177
［10］ Higgins D R, Cregg J M. Introduction to Pichia pastoris.
Methods Mol Biol, 1998, 103: 1~15
［11］ Romanos M A, Scorer C A, Clare J J. Foreign gene expression in
yeast: a review. Yeast, 1992,8(6):423~488
［12］ Graham G J, Maio J J. A rapid and reliable method to create
tandem arrays of short DNA seguences. BioTechniques, 1992,13(5):
780~789
［13］ Cregg J M, Vedvick T S, Raschke W C. Recent advances
in the expression of foreign genes in Pichia pastoris.
Bio/Technology, 1993,11:905~910
［14］ Cregg J M,Madden K R, Barringer K J et al. Functional
characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast
Pichia pastoris. Mol Cell Biol, 1989, 9:1316~1323
［15］ Waterham H R, Digan M E, Koutz P J, et al . Isolation of the
Pchia pastoris glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase gene and
regulation and use of its promoter. Gene,1997,186:37~44
［16］ Akira M,Yumiko T A,Yukio A,et al.Production of recombination
human midkine in yeast,Pichia pastoris. J Biosci
& Bioeng, 2000, 90(4): 395~399
［17］ Yamada M. Secretion of human intracellular aspartic proteinase
cathepsin E expressed in the methylotrophic yeast and
characterization of produced recombinant cathepsin E.BBA,
1994,120(6): 279~285
［18］ 赵翔，霍克克，李育阳毕赤酵母的密码子用法分析生物工程学报，2000,16(3)：308~311
Zhao X, Huo K K, Li Y Y. Chinese Journal of Biotechnology,
2000,16(3):308~311
［19］ Hoekema A, Kastelein R A, Vasser M, et al. Codon replacement
in the PGK1 gene of Saccharomyces cerevisiae: experimental approach
to study the role of biased codon usage in gene expression. Mol
Cell Biol, 1987, 7: 2914~2924
［20］姚斌，张春义，王建华，等高效表达具有生物学活性的植酸酶的毕赤酵母中国科学(C辑)，1998,28(3)：237~243
Yao B, Zhang CH Y, Wang J H, et al. Science in China (Series C),
1998,28(3):237~243
［21］ Van den Steen P, Rudd P M, Dwek R A, et al. Concepts and
principles of Olinked glycosylation. Crit Rev Biochem Mol Biol,
1998, 33: 151~208
［22］ Otvos L J, Krivulka G R, Urge L, et al. Comparison of the
effects of amino acid substitutions and betaN vs
alphaOglycosylation on the Tcell stimulatory activity and
conformation of an epitope on the rabies virus glycoprotein.
Biochim Biophys Acta, 1995,1267: 55~64
［23］ Duan Z, Li F Q, Wechsler J, et al. A novel notch protein, N2N,
targeted by neutrophil elastase and implicated in hereditary
neutropenia. Mol Cell Biol, 2004, 24: 58~70
［24］ Borgheresi R A, Palma M S, Ducancel F, et al. Expression and
processing of recombinant sarafotoxins precursor in Pichia
pastoris. Toxicon, 2001, 39: 1211~1218
［25］ Pan X, Cao G W， Ke C W, et al. Structure and function of
vascular endotheliol growth factor and its related
proteins. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 1999,31(4):
357~361
The Advances and Application in the Expression of
Heterologous Gene in Pichia pastoris
ZHANG WukuiFAN QinglinSONG Lihua
(Anhui Medical UniversityHefei230032, China)
AbstractPichia pastoris is a new eukaryotic expression
system with great potentials, has unexampled advantages in
expressing the heterologous proteins and has gotten more and more
wide application. The following aspects were described in detail:
the advantages of Pichia pastoris in the expression of heterologous
genes, the mechanism of the heterologous gene integrations, the
glycosylation of the expressed protein and the modification of the
posttranslated protein.
