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Western blot相关试剂的配制

2015-01-06 09:25阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/1611134672

Western blot相关试剂的配制

1) 1.0 mol/L Tris（pH8.8）：称量60.55g Tris置于1L烧杯中，加入约400mL去离子水，充分搅拌溶解。用浓盐酸调节pH值至8.8，定容至500mL，室温或者4℃保存。
2) 1.0 mol/L Tris（pH7.5）：称量60.55g Tris置于1L烧杯中，加入约400mL去离子水，充分搅拌溶解。用浓盐酸调节pH值至7.5，定容至500mL，室温或者4℃保存。
3)
1.0 mol/L Tris（pH6.8）：称量60.55g Tris置于1L烧杯中，加入约400mL去离子水，充分搅拌溶解，用浓盐酸调节pH值到6.8，定容至500mL，室温或者4℃保存。
4) 30%丙稀酰胺（100mL）：称量丙烯酰胺29g，双丙烯酰胺1g，加入约60mL去离子水，充分搅拌溶解，定容至100mL，4℃保存。
5) 10% SDS：称量10g高纯度（电泳级）的SDS置于200mL烧杯中，加入约80mL去离子水，加热溶解，定容至100mL，室温保存。
6) 10%过硫酸铵（Ammonium persulfate，AP）：称量1g过硫酸铵，加入约10mL去离子水后搅拌溶解，储存于4℃。
7) 5×SDS上样缓冲液（5mL）：1mol/L Tris·HCl（pH6.8）1.25mL、二硫苏糖醇（DTT，MW154.5）0.39g、SDS 0.5g、溴酚蓝0.025g、甘油2.5mL、混匀后，定容至5mL，分装于1.5mL离心管中，4℃保存。
8) 电泳缓冲液：称取Tris 6.07g、Glycine 37.55g、SDS 2.0g于烧杯中，加入2L双蒸水溶解，室温保存。
9) 转膜缓冲液：称取Tris 5.8g，甘氨酸11.6g、SDS 0.75g于烧杯中，加入700mL双蒸水，溶解后定容至800mL，最后加入甲醇200mL。
10) TBS缓冲液：称取NaCl 8.8g于800mL蒸馏水中，溶解，加入10mL 1mol/L Tris HCl（pH7.5），定容至1L，室温保存。
11) TBST缓冲液：1L TBS缓冲液中加入20% Tween20 5mL，使Tween20的终浓度为0.1%，现用现配。
12) 封闭液，抗体稀释液：TBST缓冲液中加入5%脱脂奶粉或BSA，现用现配。

表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液
溶液成分
 不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）
5
 10
 15
 20
 25
 30
 40
 50
6%







水
 2.6
 5.3
 7.9
 10.6
 13.2
 15.9
 21.2
 26.5
30%丙烯酰胺溶液
 1
 2
 3
 4
 5
 6
 8
 10
1.5 mol/L Tris (pH8.8)
 1.3
 2.5
 3.8
 5
 6.3
 7.5
 10
 12.5
10% SDS
 0.05
 0.1
 0.15
 0.2
 0.25
 0.3
 0.4
 0.5
10%过硫酸氨
 0.05
 0.1
 0.15
 0.2
 0.25
 0.3
 0.4
 0.5
TEMED
 0.004
 0.008
 0.012
 0.016
 0.02
 0.024
 0.032
 0.04
8%







水
 2.3
 4.6
 6.9
 9.3
 11.5
 13.9
 18.5
 23.2
30%丙烯酰胺溶液
 1.3
 2.7
 4
 5.3
 6.7
 8
 10.7
 13.3
1.5 mol/L Tris (pH8.8)
 1.3
 2.5
 3.8
 5
 6.3
 7.5
 10
 12.5
10% SDS
 0.05
 0.1
 0.15
 0.2
 0.25
 0.3
 0.4
 0.5
10%过硫酸氨
 0.05
 0.1
 0.15
 0.2
 0.25
 0.3
 0.4
 0.5
TEMED
 0.003
 0.006
 0.009
 0.012
 0.015
 0.018
 0.024
 0.03
10%







水
 1.9
 4
 5.9
 7.9
 9.9
 11.9
 15.9
 19.8
30%丙烯酰胺溶液
 1.7
 3.3
 5
 6.7
 8.3
 10
 13.3
 16.7
1.5 mol/L Tris (pH8.8)
 1.3
 2.5
 3.8
 5
 6.3
 7.5
 10
 12.5
10% SDS
 0.05
 0.1
 0.15
 0.2
 0.25
 0.3
 0.4
 0.5
10%过硫酸氨
 0.05
 0.1
 0.15
 0.2
 0.25
 0.3
 0.4
 0.5
TEMED
 0.002
 0.004
 0.006
 0.008
 0.01
 0.012
 0.016
 0.02
12%







水
 1.6
 3.3
 4.9
 6.6
 8.2
 9.9
 13.2
 16.5
30%丙烯酰胺溶液
 2
 4
 6
 8
 10
 12
 16
 20
1.5 mol/L Tris (pH8.8)
 1.3
 2.5
 3.8
 5
 6.3
 7.5
 10
 12.5
10% SDS
 0.05
 0.1
 0.15
 0.2
 0.25
 0.3
 0.4
 0.5
10%过硫酸氨
 0.05
 0.1
 0.15
 0.2
 0.25
 0.3
 0.4
 0.5
TEMED
 0.002
 0.004
 0.006
 0.008
 0.01
 0.012
 0.016
 0.02
15%







水
 1.1
 2.3
 3.4
 4.6
 5.7
 6.9
 9.2
 11.5
30%丙烯酰胺溶液
 2.5
 5
 7.5
 10
 12.5
 15
 20
 25
1.5 mol/L Tris (pH8.8)
 1.3
 2.5
 3.8
 5
 6.3
 7.5
 10
 12.5
10% SDS
 0.05
 0.1
 0.15
 0.2
 0.25
 0.3
 0.4
 0.5
10%过硫酸氨
 0.05
 0.1
 0.15
 0.2
 0.25
 0.3
 0.4
 0.5
TEMED
 0.002
 0.004
 0.006
 0.008
 0.01
 0.012
 0.016
 0.02

表2 配制6% Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液
溶液成分
 不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）
1
 2
 3
 4
 5
 6
 8
 10


　
 　
 　
 　
 　
 　
 　
水
 0.68
 1.4
 2.1
 2.7
 3.4
 4.1
 5.5
 6.8
30%丙烯酰胺溶液
 0.17
 0.33
 0.5
 0.67
 0.83
 1
 1.3
 1.7
1.5 mol/L Tris (pH8.8)
 0.13
 0.25
 0.38
 0.5
 0.63
 0.75
 0
 1.25
10% SDS
 0.01
 0.02
 0.03
 0.04
 0.05
 0.06
 0.08
 0.1
10%过硫酸氨
 0.01
 0.02
 0.03
 0.04
 0.05
 0.06
 0.08
 0.1
TEMED
 0.001
 0.002
 0.003
 0.004
 0.005
 0.006
 0.008
 0.01
室温保存。

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