大肠杆菌优化步骤-个人费心总结
2014-02-19 21:52阅读：
下面是一个四连罐（新购买）的优化步骤，使用的菌种为大肠杆菌BL21（DE3）。
优化整体思路
1.
发酵罐性能测试，平行性测试，熟悉发酵罐的特征
首先需要对发酵罐的整体性能进行测试，考察各个监控参数，各种测量仪器（温度等电极）的稳定性。另外，需要对四个罐的平行性进行测试，保证今后四个罐不同的结果不受本身罐体差异的影响。
2.
重复性测试
例如A罐，三个批次是否具有可重复性。保证今后的发酵过程中的稳定性。
3.
种子优化
种子优化计划采用四连罐中的某个罐作为种子罐，其它三个作为发酵罐。主要包括种子培养基优化，接种量和接种时机优化。其中，种子培养基最为关键，以后大规模生产时，摇瓶各个阶段都采用LB培养基，发酵罐前一个为种子罐，其培养基的确定可能需要根据最终发酵培养基来确定，原则是与发酵培养基大致相通，成分尽可能的简化，最少时间达到最高OD值等。
4.
发酵工艺的优化1——发酵培养基的优化
首先需要验证各种文献，
尽可能的拓展我们的思路，保证每一次发酵结果能得到可用的结论，最终得到几个效果较好的培养基。
其次对这些培养基进行大幅调整，快速找到影响产量的因素。
最终，对最后的培养基进行成本核算，对影响成本的培养基成分调整或者替换，降低发酵成本。
5.
发酵工艺的优化2——发酵条件的优化
以诱导前后作为节点，对诱导前后的温度，pH，溶氧，残糖含量等进行优化。
6.
发酵工艺的优化3——诱导条件的优化
诱导剂加入时机，诱导剂的含量，诱导剂加入方式（主要考虑是否需要采用流加），诱导剂的替换（IPTG价格太贵，大生产并不合适，验证是否可替换成乳糖）
7.
物料优化
主要是考虑到物料的稳定性问题
8.
发酵罐结构验证
实验的目的是测试发酵罐自身结构对发酵的影响，对于可以调整的部件进行优化。
9.
通用性测试
换菌种进行测试，看此套培养基和发酵工艺是否对别的菌种适用。一旦结果不理想，接下来要做的工作是对上述方案进行逐项的验证，看哪些是通用，哪些是对菌种有特异性的要求。
10.
其它优化
Amp的保质期验证；
Amp是否会分解，是否需要流加；IPTG的保质期验证；微量元素混合液的保质期验证，保存方式的验证；放大的优化；各种发酵成分是否有必要分开灭菌。等等。
这部分验证没有在下面详述，在后期的优化中可能会穿插性的验证。
具体优化策略
代称：A,B,C,D代表四个发酵罐。M0（目前使用的培养基）；M1、M2、M3和M4···等为几套参考文献的培养基，对应的发酵工艺也为P0，P1，P2以此类推。
发酵周期：以两天为一轮（暂定，四个发酵罐的工作量可能要大于目前正在运行的四个发酵罐的工作量）。
种子选择：共表达体系。目前这个项目酶活数据与投二酮反应的结果并不一致，可能与该酶对异丙醇和二酮的催化活性不相同。个人建议可以考虑换一个投反应与测酶活一致的种子。
前期优化
第1轮：A,B,C,D四个发酵罐全部使用M0培养基，P0工艺发酵。种子为7234，下同。
第2轮：A:
M0培养基，P0工艺（培养基和工艺无特殊说明，都是一一对应，即M0培养基对应P0发酵工艺）；B:
P1工艺，即以前优化过的第一套优化方案；C:
P2工艺，即以前优化过的第二套优化方案；D:
P3工艺，即以前优化过的第三套优化方案。
注：第二轮优化后，进行详细的数据分析，大家讨论选择最佳方案。
第3轮：A:
P0工艺。B：最佳方案的重复试验；C：P4工艺（需要查找文献，或者参考大家的意见）；D：P5工艺（需要查找文献，或者参考大家的意见）
发酵工艺优化1
第1，2轮：发酵培养基的优化
在前期优化得到的最好工艺的基础上，首先对培养基进行优化。
具体方法为7因素2水平的正交实验，具体要根据前期培养基来确定。现在暂不列出。
第3轮，第4轮：此轮优化使用同样的种子和同样的培养基（根据前面的结果选择）。
发酵罐
|
4轮A
|
4轮B
|
4轮C
|
4轮D
|
5轮A
|
5轮B
|
5轮C
|
5轮D
|
诱导前温度
|
32
|
32
|
32
|
32
|
37
|
37
|
37
|
37
|
诱导后温度
|
20
|
30
|
30
|
30
|
20
|
20
|
30
|
30
|
诱导前pH
|
6.8
|
6.8
|
7
|
7
|
7
|
7
|
6.8
|
6.8
|
诱导后pH
|
6.8
|
7
|
6.8
|
7
|
6.8
|
7
|
6.8
|
7
|
诱导前罐压
|
恒定0.03
|
保证溶氧
|
恒定0.03
|
保证溶氧
|
保证溶氧
|
恒定0.03
|
保证溶氧
|
恒定0.03
|
诱导后罐压
|
0.03
|
0.08
|
0.08
|
0.03
|
0.03
|
0.08
|
0.08
|
0.03
|
补料控制方式
|
X
|
Y
|
Y
|
X
|
Y
|
X
|
X
|
Y
|
注1：补料方式X：恒速补料
；补料方式Y：溶氧stat补料
注2：根据结果可能需要再次设计试验，进行优化。
第5轮
补料的优化：根据前几个批次发酵结果确定实验。
发酵工艺优化2
第1轮：此轮优化前，进行若干轮摇瓶优化，确定最佳的诱导剂含量，根据优化结果再行优化。
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
诱导时机
|
1/5
最终OD
|
1/2 OD
|
3/4 OD
|
5/6 OD
|
第2轮：
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
诱导时机
|
上轮次之OD值
|
上轮次之OD值
|
上轮最佳OD值
|
上轮最佳OD值
|
诱导剂加入形式
|
直接加入
|
诱导后恒速加入，同时加入合适含量的amp
|
直接加入
|
诱导后恒速加入，同时加入合适含量的amp
|
诱导剂含量
|
摇瓶最佳值
|
IPTG最佳含量*最终OD值/7
|
IPTG最佳含量*最终OD值/7
|
摇瓶最佳值
|
第3轮：诱导阶段的补料不能使用葡萄糖，到时候需要根据前面的优化结果，乳糖诱导的效果再加入成本衡算确定是否需要使用乳糖作为诱导剂。
此轮优化诱导后，不适用葡萄糖作为补料碳源（一般使用甘油），使用乳糖作为诱导剂
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
诱导剂加入量
|
0.5mM
|
0.5mM
|
4mM
|
4mM
|
诱导剂加入形式
|
直接加入
|
诱导后恒速加入，同时加入合适含量的amp
|
直接加入
|
诱导后恒速加入，同时加入合适含量的amp
|
种子优化
第1轮：根据发酵培养基，根据经验和大家讨论结果确定种子培养基成分。优化的指标确定为最短时间达到最高OD为最佳，最后通过种子罐-发酵罐验证。过程中要做好生长曲线，得到生长期的各个时间点。
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
种子培养基
|
seedM1
|
seedM2
|
seedM3
|
seedM4
|
第2轮：种子培养条件的优化
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
温度
|
30
|
30
|
37
|
37
|
pH
|
6.8
|
7
|
6.8
|
7
|
第3轮：接种时间选择
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
作用
|
种子罐
|
发酵罐
|
种子罐
|
发酵罐
|
接种时间
|
对数中期
|
|
对数后期
|
|
第4轮：接种量的选择
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
作用
|
种子罐
|
发酵罐
|
种子罐
|
发酵罐
|
接种时间
|
3%
|
|
10%
|
|
第5轮：摇瓶种子稳定性
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
摇瓶种子保存时间
|
立即
|
1周
|
2周
|
4周
|
物料优化
第1轮：物料来源优化
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
碳源
|
A厂家
|
B厂家
|
A厂家
|
B厂家
|
氮源
|
C厂家
|
D厂家
|
D厂家
|
C厂家
|
第2轮：物料稳定性测试
物料稳定性只要考虑到的是氮源（例如酵母粉，不同厂家使用的菌种不同，生产出来的酵母粉各种微量元素也不相同，有些厂家批次之间由于处理不同，也会造成产品有所差异），其次碳源也有影响，至于无机盐一半批次之间变动性较小。
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
氮源
|
批次1
|
批次1
|
批次2
|
批次3
|
碳源
|
批次1
|
批次2
|
批次1
|
批次1
|
发酵罐结构验证
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
发酵罐结构
|
对照实验
|
搅拌叶的影响
|
挡板的影响
|
空气分布器的影响
|
通用性实验验证
第1轮：
发酵罐
|
A
|
B
|
C
|
D
|
发酵种子
|
7234
|
FDH
|
另外种子1
|
另外种子2
|
优化结束！
