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第十二节：基因重组与基因转位——同源重组

2010-01-14 15:58阅读：

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第十二节：基因重组与基因转位——同源重组


信息来源：37C医学网　更新时间：2004-6-22 21:17:00
同源重组
　　遗传交叉（crossover）是经常发生的，特别是在减数分裂时，同源染色体在每一代都发生于有相同或几乎相同的顺序的两个DNA节段之间。通常，这两个节段是同源染色体的两个相应区域；但是交叉也可发生在非相应区域的同源片段之间。这种不对称的交叉可在染色体中产生重复和缺失。在实验室中，我们常借助于不同DNA片段之间的重组来构建新的遗传变种。例如，将酵母的某个基因克隆到细菌质粒中，然后将这个重组DNA转化入另一株具有不同的酵母细胞中，则同源顺序之间会发生交叉，从而将质粒插入酵母细胞染色体中。
　　任意两个同源性DNA片段在细胞内均可能重组。但是要做到这一点，两个同源双链DNA分子必须紧密接触，相对应方能交换，这就称为联会（
synapsis）。重组时，两个DNA自从片段必须有一个发生断裂或有一段单链缺失（称为“空隙gap”）。因此，许多DNA损伤因素，像UV照射、X光辐射、和诱变剂等均可使重组频率增高。
一、RecA蛋白在重组中的功能
　　RecA蛋白是recA基因的产物，分子量约38000D，为含４个亚基的四聚体。即使DNA分子有断裂或“空隙”，两个DNA分子也不一定重组。必须有推动重组反应的酶存在，重组才能进行。在这些酶中最主要的是RecA蛋白，它能促使两个同源DNA分子的碱基配对，形成杂种分子。反之，两条完整的同源双链螺旋DNA，即使和RecA蛋白一起混合，也不会发生重组反应。RecA蛋白能特异地识别单链DNA，并能将之与同源双螺旋中的互补顺序“退火”，同时将另一条链排挤出去，形成所谓D环（D－１OOP）。
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　　RecA蛋白首先与单链DNA结合（约每分子可结合５个核苷酸），形成一条DNA－蛋白质细丝（需消耗ATP）。于是RecA蛋白即被活化而可将双螺旋解旋和分离，同时企图将它结合的单链与被解旋区域退火，如此继续下去，直到找到互补顺序。只要一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供应的能量就会继续驱使配对反应趋于完成，其方向是５’→３’（单链部分）。当新的杂交双链形成时，RecA蛋白即从原来的单链掉下来。所以，DNA上的断裂和“空隙”有起始重组的作用。断裂和“空隙”能提供核酸酶的作用位点，以降解双螺旋中的一条链；或能提供解旋的酶的进入部位，从而暴露出能与RecA蛋白相结合的单链DNA。
二、Holliday结构
　　按照上述，单链DNA要和双螺旋DNA中的一条互补链进行配对（RecA蛋白促进此反应）时，该双螺旋的两条链必须首先解旋和分离。原先人们就是这设想的。然而现在认为另有一种可能性：单链DNA分子可以包在双螺旋的周围，并与之对齐。和RecA蛋白结合的单链同样可以在双螺旋DNA分子的大沟中与后者的一条链相接触，从而能从“外部”来认识是否有互补顺序。这种“三螺旋”只是碱基的开始识别过程，接着双螺旋解开，入侵的单链于是和它的互补链形成正常的碱基对。三螺旋显然有利于找到同源顺序，因为在找到同源顺序之前不需要将双螺旋解旋。照这样说，如果是两个DNA双螺旋分子进行交叉重组，则将形成一个“四螺旋”作为中间物。这样的中间物的存在是R.Holliady在六十年代首先提出来的，称为Holliday结构，或交叉结构。
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　　因此可以想象，在重组部位处，每个双链中均有一段DNA链来自另一个双链中的对链。这个部分就称为异源双链（hetero duplex），或称杂种DNA。在重组DNA分子的异源双链中，虽然两条链并不完全互补，但绝大部分的碱基也已成对，不会出现大段的单链部分。例如，噬菌体fd和M13二者的DNAs约有97％是同源的，在一起时即可进行重组。由于DNA主要链是可以自由旋转的，所以在交叉处，单链可以从一条双螺旋中进入另一条双螺旋中，从而使此交叉点可以像拉链一样滑来滑去，而仅使原先两条双螺旋上的对等碱基互相交换配对而已。一旦链的交换开始，交叉点即可沿着两条双链移动，这称为分支迁移（branch migration）。分支迁移的速度不定，大致为３０bp/sec。通过这种办法，某条单链上相当长的一节可从一条双螺旋上转移到另一条上去，形成长节段的杂种双链DNA。因此，从原来的裂处开始，DNA链可以在两条双螺旋之间进行交换相当长的距离。这样，在交叉时就经常会出现异源双链的节段，这是因为从原始配对区可因分支迁移而向其邻近区域延伸，从而将两个染色体中有遗传差异的位点也包括进去。几乎所有病毒DNA均有异源双链区。在T４噬菌体DNA分子中每隔数千核苷酸即有这样一个异源双链区。但异源双链的使其子代转变为不同的同源双链（homo duplex）。
　　Holliday结构的另一个重要性质是能够发生立体异构现象。这种异构转变是一种立体或空间重排（rearrangement），使得作为“桥”的链（即连接两条螺旋的交叉部分）转变为“外部”链，而原来的外部链则转变为“桥”链，最后由核酸酶将交叉处切断（称为解离resolution）而最后完成重组作用。这种异构转变在体内是经常发生的，它可以导致两条子链发生双重交换，或所有四条链发生单交换。噬菌体DNA分子的电子显微镜照相常常可以给这种链的交换以直接证据。
　　进行同源重组至少要有多长的同源序列呢？实验证明如果同源顺序短于75bp，则重组频率大降低。这个长度要比两条互补的单链形成双链所需的长度（约10bp）要长得多。
三、RecA蛋白在开始仅将一条单链转移入一条DNA螺旋中，但接着就出现第二个交换。
　　RecA蛋白如何能在体外促使两条相同的双螺旋（其中之一在一端有一“空隙”）进行完全的重组? 当RecA蛋白将“退火”进行到空隙的边缘时，分支迁移即可将上方的双螺旋解旋，并同时形成第二个新的杂种螺旋。另外，RecA蛋白也能够在交叉部位的左方将两条DNA双螺旋组成一条四条链的螺旋，从而使各自的单链易于互相交换，并进行分支迁移。在重组修复中，RecA蛋白是结合在远离双螺旋两端的“空隙”上，这时细胞内重组作用的起始，要由核酸酶在完整双螺旋上切开一个缺口，再从断端开始向左形成新的双螺旋。
四、RecBC酶的作用 1059-1a.jpg (42620 bytes)
　　在重组中，RecA蛋白负责基本的碱基配对，但还需要另一些蛋白质来完成同源重组，其中最主要的是RecBC酶。RecBC酶是由recB和recC基因编码的，其分子量约为300,300，具有使DNA解旋的和核酸酶活性。它能够在单链DNA上作一切口，从而使此单链（在与RecA蛋白结合后）能侵入同源双螺旋。RecBC酶的一个重要性质是它仅能在含有游离双螺旋端的DNA分子上起始其解旋作用。它首先结合在又螺旋的游离端上，然后利用ATP供给的能量沿着双螺旋向前推进。在其行经之处，一路上解旋并又复旋。但由于解旋的速度快于复旋速度，所以解旋的双链区就越来越长。因为解旋和复旋作用的位点都必须结合在酶分子上，故在电子显微镜照片中这种解旋部分会形成两个单链的环，称为“兔耳（rabbit ears）”。RecBC酶的另一重要性质是它最喜欢在含有称为Chi(％)位点的DNA分子上促进重组作用。Chi的核苷酸顺序是５’GCTGGTGG３’。这些部位是重组频率较高的部位。当解旋的DNA链上有Chi位点时，RecBC酶就是出现特异的核酸酶活性，能将靠近Chi处（约离Chi４－６碱基处）的单链切断。这样，当RecBC酶再向前进时，就不会再行复旋。这个后果就是留下了一个游离单链端和一段“空隙”。RecA蛋白就结合在此二者上，并能开始与同源序列进行DNA链交换。RecA蛋白需要的单链DNA至少长约５０核苷酸。
　　据报道，E.coliDNA上约有一千拷贝Chi序列，或者说每５个基因便有１个Chi作为RecBC酶的作用部位。但在正常细胞中RecBC酶并不作用于Chi序列，因为正常时DNA没有游离端。但在细菌进行接合时，情况就不同了。因为雄菌可将一个DNA游离端送入雌菌，在雌菌体内RecBC酶立即结合在此游离端上并向前推进，在到达Chi时切割此链，从而促进此链与受体菌DNA发生重组。其他情况如噬菌体P１转导细胞和噬菌体λ感染细胞时均可出现DNA游离端，并借助于RecBC酶而发生重组。
五、参与同源重组的其他蛋白质
　　除recA、recBrecC外，E.coli中还有几个基因，其产物参与重组作用，但其详细功能尚不详。其中之一是一种核酸酶，它能将Holliday结构的交叉处切断，从而将重组DNA分子解离。但亦有人认为这亦是RecBC酶的功能。有几个为DNA复制所必须的蛋白质亦在重组中起作用。例如单链DNA结合蛋白（SSB）能帮助RecA蛋白井然有序地和单链DNA结合，DNA聚合酶则能填补重组DNA的上“空隙”。当然，最后尚须DNA连接酶将缺口封好。
六、交叉错误
　　两条DNA链在形成氢链时，其互补的单链区能精确地相互对齐。然而，假设一段链有１２个核苷酸，则它偶然遇见另一条同长度的单链正好与它完全互补的机会几乎是绝无仅有的。因此，某个基因中的一个片段（只要它足够长）被该基因或另一基因中的另一段相配合一般是不可能的。然而，在罕见的情况下，当染色体的两个不同部位正好有相当高的同源性，那末错误的相配也会发生，从而会引起大段核苷酸的插入或缺失。这种意外的重排通常也是由RecA蛋白所催化的。
生物频道录入：生物编辑 责任编辑：生物编辑

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