薄层层析与糖分析
2009-12-11 10:13阅读：
薄层层析与糖分析（原创，转载请注明）
1 薄层层析（TLC）简介
薄层层析是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法。
薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。
薄层层析不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。
根据分离的原理不同，薄层层析可以分为两类：用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶；用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层，属于分配薄层层析。
吸附TLC→固定相为吸附剂→氧化铝、硅胶。（较多用）
TLC→
分配TLC→固定相为液态（通常为水）→固定相吸附在支持剂上。
1.1 吸附薄层
基本原理：吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。
吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力，还受被吸附成分的性质影响，更与展开剂的性质有关。
吸附薄层层析：在硅胶薄层板上，样品中的两成分是两种结构近似的染料，在展开剂四氯化碳的作用下。在展开剂和薄层板之间不断地产生吸附、解吸，再吸附，再解吸。由于对氨基偶氮苯的极性比偶氮苯的极性稍强一些，层析的结果，对氨基偶氮苯受到的吸附作用稍强于偶氮苯，从而将两者分离。展开结束以后，会在薄层板上形成两个斑点，混合物中的成分得以分离。
特别是对未知结构的成分分析，设计并摸索出合理的层析条件是首要任务。只有先设计出可
用的层析条件，再经摸索改进，才可能对未知或者已知成分进行成功地分离。然后才能谈得上进一步的分析研究。
薄层层析的三项基本构成物质是：样品组分、吸附剂、展开剂。摸索层析条件，实际上是协调上述三者的关系，寻求一种能够有效分离样品组分的配合方案及实际操作要领。层析条件的选择是以样品中的各组分为中心，适当调适展开剂的吸附剂的极性来实现的。
1.2 分配薄层层析
用极性溶剂吸在固体支持剂上所形成的混合物，铺成薄层（或装柱），然后活化、点样（或上样），再用极性较弱的展开剂（或洗脱剂）进行展开。
原理：在展开过程中，各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配，由于各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的。
以CS表示某成分在固定相中的浓度，Cm表示某成分在固定相中的浓度。则分配系数：K＝CS/Cm
分配层析所用的固定相一般为水及各种水溶液（酸、碱、盐与缓冲液）、甲酰胺、低级醇（亲水性）等。分配层析所用的流动相选用与水不溶（或微溶）的有机溶剂。如石油醚、苯、卤代烷类、脂类、酮类（如丁酮）、醇类（丁醇、戊醇）等或者它们的混合物。
分配层析对混合物中各成分的分离，主要决定于各成分分配系数的差异，一般说来，对于种类成分均能适用，特别能适用于水溶性、亲水性物质而又稍能溶于有机溶剂中者。这样就恰好弥补了一般吸附层析（如氧化铝吸附层析适用于亲脂性物质）的不足。但是，由于分配柱层析样品处理量较少，因此，如能用吸附柱层析解决问题时，常优先使用氧化铝或硅胶吸附柱层析。
1.3 薄层层析定性与定量分析
薄层层析可以对物质成分进行定性和定量测定。
定性分析——根据日光或紫外光，不同成分的不同显色，判定物质的组成成分
定量分析——洗脱法测定成分含量或薄层扫描法测定含量
1.3.1定性检测
1）物理方法：主要紫外灯下检测，利用物质在254、365nm这两个单色光下产生不同颜色不同强度荧光来检测或利用在该光下不产生荧光而在荧光板上成为暗斑的方式检测。
2）化学方法：主要指显色剂显色法：显色剂分通用型和专属型。通用型能广泛的与不同类型化合物反应。专属型对某类化合物，共有某种功能基化合物起反应。常见通用型显色剂有碳化试剂（含不同浓度的酸）、磷钼酸、三氯化锑、还有水。专属型显色剂，较多、复杂、具体物质可照药典操作及查阅有关文献资料。
3）生物方式：将某些特定细菌的凝胶混悬液倒在展开后的薄层板上，用适当温度培养一段时间，以此检测某些具有抑菌或杀菌的活性物质。
1.3.2 定量测定
1）斑点刮取定量：
刮取随行对照品同位置供试品的斑点，用适当溶媒提取后，用紫外分光法、气相法、原子吸收分光光度等色谱手段测定。
2）直接定量：
a比斑点面积：用每格1mm2透明格纸盖在薄层板上测量斑点所占面积mm2与对照品相互比较，定量误差在10-20之间。
b薄层扫描法：实际工作原则是：用一束长宽可以调节的一定波长一定强度的光，照射在薄层板斑点上，进行扫描，用仪器测量通过斑点的光束强度的变化，从而达到定量的目的。
测定方式分类：反射法：测量反射光的强度。
透射法：测量透射光的强度。
扫描方式分类：单波长法、单光束法；单波长、双光束法；双波长法。
薄层扫描仪的组成：光源、单色器、薄层板台架及驱动装置、检测器、数据处理仪。操作方法步骤有供试品前处理、点样、展开、上机扫描、数据处理。
2 薄层层析法一般步骤
2.1薄层的制备
1）基板的规格和构成：5×15㎝、5×20㎝、10×10㎝、20×20㎝大小的玻璃板或者不锈钢板、塑料板。
2）薄层板的分类：软板（制板时不加粘合剂）、硬板（制板时加入粘合剂）。
3）软板的制备：
4）硬板的制备
2.2 薄层层析的操作步骤
1）点样：
A:样品的溶解：将样品溶于展开剂极性相近、挥发性高的有机溶剂。
B:薄层点样：用毛细管（0.5mm以下）或用专业点样器进行点样。
2）展开：当样点上的溶剂充分挥干后，将薄层放置在密闭容器中，使适当的展开剂从薄层的一端向另一端进行浸润展开的过程。
要求：密闭容器可选用层析缸、标本缸、标本筒等；展开方式有上行法、下行法之分，展开方向有单向、双向、多次展开等。
3）显色：用适当的方法或者适当的显色剂处理薄层，使其上可能已经分离的各成分斑点显示出来，以方便计算各个斑点的比移值，从而提供定性与定量的依据。显色的基本步骤是：一看、二照、三碘、四显，荧光背景也常见。
4）比移值的计算与定性、定量：展开结束后，经过各种显色操作后，样品中各个成分的斑点可能出现了不同程度的分离，为了表达各成分的相对位置（极性）通常以比移值作为称量斑点位置的指标。比移值的符号为Rf：Rf＝(斑点中心与原始样点之间的距离)/(溶剂前沿与原始样点之间的距离)
3.薄层层析与糖分析
单糖组分的分离测定方法目前主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)等。
采用GC
测定糖类，遇到的主要困难是糖本身没有足够的挥发性，所以必须在气相色谱分析之前预先转化成易挥发、对热较稳定的衍生物。另外，由于糖的异构化，在某些衍生物的制备过程中，会产生衍生物的异构体，使色谱分析时每种糖产生几个峰，这往往影响组分的分离和定量。
HPLC
有分离速度快、分辨率高、分离效果好、重现性好、不破坏样品的优点。但糖类本身没有紫外吸收，只能采用示差折光检测器(RI)或蒸发光散射检测器(ELSD)检测。RI
分辨率低而ELSD 虽然效果好但目前价格昂贵。另外，采用 HPLC
分析时，色谱柱的选择也比较困难。一般采用氨基柱但分离效果欠佳，而专用的糖柱又十分昂贵。
薄层色谱法(TLC)是一种微量而快速的分析方法。它兼备了柱层析和纸层析两者的优点并且操作方便，设备简单，容易掌握、便宜、灵活，分离快速、操作方便、同时分离多个样品、样品预处理简单、设备简单。由于这些特点，薄层色谱在实际工作中的应用十分广泛。采用适合的吸附材料制作薄层和展开剂可分离各种糖类物质，进而采用显色剂显色，而后利用薄层扫描仪或成像系统可以对组成成分进行定量分析。但薄层层析较易受环境因素影响，且TLC各项操作如点祥、展开、检测、光密度扫描各自需要独立的方法，且在灵敏度和准确度上，要低于HPLC法。
糖为多羟基化合物，具有较强的极性，在硅胶
G薄板上展层时，糖与硅胶分子有一定的吸附力。硅胶分子与糖的吸附能力大小取决于糖的分子量和羟基数目，不同的糖分子由于分子量及羟基数的不同，因而它与硅胶分子间的吸附力不同。造成各种糖分子在展层过程中移动的距离不同，从而将各种糖分离出来，一般吸附力的大小为：三糖>双糖>己糖>戊糖。其中各种糖移动的速率可用
Rf值表示。通过与标准糖的Rf值比较。即可鉴定出成分中糖的种类。
4 薄层层析需要的仪器和试剂
主要仪器：
烧杯（50ml），量筒（25ml），记号笔，研钵，硅胶板或玻璃板（薄层层析用），分析天平（万分之一），紫外检测器，微量移液管或微量注射器，层析缸，恒温水浴锅，毛细管，吹风机，烘箱，喷雾器，薄层层析扫描仪或成像系统（定量测定需要）
主要试剂：
支持剂（常用的是硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素等），展开剂（多为有机溶剂），显色剂（根据实验配置），糖标准液（自配），硼酸，冰醋酸等。
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