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2.5
dNTP
 2.5
forward primer(20um)
 1.5
down primer(20um)
 1.5
模板（来自质粒）
 1
Taq Pol
 0.4
总量
 25

程序如下：
95℃，2 min
30 cycles: 95℃，10 s；54℃，30 s；72℃，1-3 min（延伸时间为普通时间×2）
72℃，7 min
4℃ forever
② PCR扩增DNA-DIG标记，用PCR DIG mix，10×cone，其它一切同①一样，只是dNTP换成DIG mix
③ 2％胶电泳①和②产物，带DIG的DNA片段应大于不带标记的
2 μl PCR product 点样，检测亮度与特异性；
2 μl DNA DIG probe 点样，检测亮度与特异性。
④标记好的探针（DIG的PCR产物）放在-20℃保存
注：1.所用瓶子都要专用，事前用DEPC处理后，用无菌水配制所有溶液；
2.整个过程膜不能用手碰，不能折！不能用夹子夹中间；
3.换溶液手要快，别磨磳。
二、RNA的甲醛变性电泳（共两次）
第一次制胶跑电泳为定量用，第二次制胶跑电泳才留做转膜用
① 制甲醛变性胶（1-2％）放置1 h以上才能用（3h以内）
1.5 g Agarose+94.6 ml 1×MOPS buffer，微波炉加热5 min（瓶子封闭不开盖），冷却50-60℃，加入5.4 ml 37％甲醛，一直于通风橱内搅拌，倒胶也在通风橱中进行，上下用保鲜膜包好。
10×MOPS buffer配方：0.2 M MOPS，50 mM乙酸钠，20 mM EDTA,最后用5 N NaOH调pH值7.0。
② RNA样品准备、
260 nm处测OD，每个样品测3次，求平均值×4=××μg/μl
上样：2份上样缓冲液（现用现配）+1份RNA，混匀，65℃变性10-15 min，冰上放置1 min，用于点样（RNA样品浓度1-5 μg），样品全部加DEPC水至10 μl，与20 μl上样buffer混匀，65℃水浴10 min，冰上放置1 min之后即可用于点样。
上样buffer配方（500 μl）：
去离子甲酰胺
 250 μl
37％甲醛
 83 μl
10×MOPS buffer
 50 μl
50％甘油
 94 μl
2.5％溴酚蓝
 3 μl
EB（200 mg/ml）
 25 μl
③电泳
（DEPC水配：1×MOPS buffer为电泳液）
电压恒压：3-4V/cm，（40-50V）时间3 h以上，也可过夜。
三、RNA的甲醛变性膜转膜
第一天晚上：
1、切胶，把胶的四周孔切去，保持胶的水平，在第一孔上方做切角，标记方向。
2、胶上面朝下，放在转移槽滤纸上，保持水平，四周用保鲜膜封好（保持水从正下方吸上来，胶的RNA不会扩散）。
3、尼龙膜（不可用手拿）切角，铺在胶上（直接铺干膜）。
4、两层滤纸（灭菌过）铺在尼龙膜上，可以在尼龙膜上加适量20×SSC起湿润的作用。
5、吸水纸3-5张叠好，大约要20叠（压下5-6 cm），平放于滤纸上，上面再加500 g重物（切记放平），过夜转12-16 h。
第二天中午：
拿下吸水纸，膜取下后，经紫外交联（2000-2500剂量）照射后，用无菌水冲洗10 min（洗去多余盐离子）,然后把膜放在滤纸上，自然凉干于抽屉中。
第二天下午4：00左右：膜预杂交
准备合适的杂交袋，50℃预热的杂交液，膜放入袋中，封好（尽量减少空间，保持膜平整），加入3-4 ml预热杂交液，封口机封好，50℃轻摇1 h。
第二天下午5：00左右：膜杂交
取适量（3 μl）DIG-DNA探针（-20℃保存），加30-50 μl DEPC水，100℃水煮5 min，冰上放置1 min；
袋中加入新50℃杂交液3-4 ml，加入探针，封口；
50℃杂交10-16 h(轻摇)。
注：20-50 ng探针/ml杂交液。
第三天早上9：00左右：洗膜
1、取干净烘干的小盒，把膜从袋中取出，正面向上放入盒中；
2、2×SSC+0.1％SDS室温摇5 min，共2次；
3、预热70℃ 0.5×SSC+0.1％SDS，68℃摇二次，15 min/次（动作要快，夹子夹边角处，防止对膜损伤）；
4、预热70℃ 0.1×SSC+0.1％SDS，68℃摇二次，15 min/次；
5、Maleic Acid Buffer室温摇2 min。
第三天早上10：00左右：膜封闭与抗体（室温）
1、取新的盒子，加20 ml 1.0％的Blocking Solution（用Maleic Acid Buffer溶解）室温摇60 min；
2、换10-20 ml抗体Solution，用Blocking Solution溶解（抗体一般1：10000），室温摇45 min。
膜清洗（室温及膜显影及检测）
1、用100 ml左右Washing Buffer摇两次，15 min/次；
2、用20 ml Detection Buffer摇3 min。
膜检测
1、正面滴一滴CDP-Star，室温放5-10 min；
2、压片检测（同Western）。

DIG标记法RNA blot所需试剂的配制
1、Maleic Acid Buffer（2升）：
maleic acid 0.1M 约23.22 g；
NaCl 0.15 M 17.532 g
定容后，加进口的NaOH颗粒约15-16 g，最后用5 N NaOH调pH 7.5，高压灭菌。
2、Washing Buffer：
灭菌后的1+3 ml Tween/L
3、20×SSC（1升）：
NaCL 3 M 175.3 g
柠檬酸钠0.3 M 88.2 g
高压灭菌
4、洗膜液：
2×SSC+0.1％SDS
0.5×SSC+0.1％SDS
0.1×SSC+0.1％SDS
把水准备好，加入1 g/L SDS后，高压灭菌，用时加入20×SSC母液。
5、Detection Buffer（1升）：
12.1 g Tris(0.1 M)
5.85 g NaCl(0.1M)
用浓HCl调pH 9.5，高压灭菌。
6、10×MOPS（1升）：
将41.8 g MOPS溶解于700 ml水中，加入50 ml 1M的乙酸钠和40 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）定容至1升，用5 N NaOH调pH=7.0，高压灭菌。
7、杂交液（250 ml）：
（1）100％甲酰胺 125 ml
（2）30×SSC 41.5 ml
（3）1M 磷酸缓冲液（NaH2PO4和Na2HPO4各1 M）

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