组培实验---实验二 外植体的灭菌、接种与初代培养

一、实验目的
通过实验初步掌握外植体材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体初代培养的方法。
二、实验原理
植物组织培养是在无菌条件下对离体的植物器官或组织的培养。而植株各部分的表面携带着各种不同的微生物，所以在接种前就必须选择合适的消毒剂对外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。离体器官或组织受到适当刺激，便可进行器官分化，从而实现细胞的全能性。
三、实验材料、试剂和仪器设备
1．实验材料：喜树当年生枝条
2．试剂：升汞，吐温-80
3.仪器设备（以各组所需为例）
无菌器材：4瓶培养基 ，一个无菌烧杯+吸水纸，1升无菌水，大号、中号镊子各1把，1把解剖刀、1把剪刀，2个500ml烧杯
非无菌材料：0.1%升汞消毒液200ml，1个250ml消毒缸，1盏酒精灯及火机1个，1个烧杯，内装75%酒精150ml，1个烧杯，内装75%酒精及棉球，1把大号镊子、1把枝剪、1把解剖刀、1把旧牙刷，橡皮筋若干、标签纸、记号笔、洗衣粉、毛巾、喷雾器
四、实验步骤
1．实验一制备的培养基即是本实验所用培养基。
2．接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台。房间用酒精喷雾降尘后打开超净工作台紫外灯及房间的紫外灯，照射约30mins；然后关闭紫外灯，打开房间换气扇以及超净工作台的风机，并微启超净工作台的玻璃挡板，通风20min后，即可进行无菌操作。
3．选取生长健壮的枝条，用饱满又未萌发的侧芽作为外植体（取中部的芽较好）。将外植体用手术刀切去叶片，并剥去附在茎上的叶柄及皮刺，用毛刷沾洗衣粉刷洗并在自来水下冲洗干净。吸干水份后切成约2-3cm的茎段，每段至少有1个侧芽。将处理好的外植体转入洁净的消毒缸中，用加了数滴吐温-80的0.1%的升汞溶液浸泡10min。在表面灭菌过程，应不停摇动消毒缸使消毒液与外植体充分接触。
4．进入接种间，用酒精棉球仔细擦拭双手至手腕部位
5．把浸泡在消毒液中的外植体转移到超净工作台中。消毒时间