沉淀法提取牛乳中的蛋白质
2010-06-17 21:43阅读：
沉淀法提取牛乳中的蛋白质
微生物0802班 品月瑚海
2008243050218
一、沉淀法简介
沉淀法是利用加入试剂或改变条件使目标产物离开溶液，生成不溶性颗粒而沉降析出。沉淀分离在生物工程中的应用是很灵活的，有时会使杂质生成沉淀而分离出去，有时也会使目标成分由液态变成固态以达到易于保存的目的。
沉淀法具有简单、经济和浓缩倍数高的特点，广泛应用于生化物质的提取分离中。它不仅适用于抗生素、有机酸等小分子物质，在蛋白质、酶、多肽、核酸和其他细胞物质组分的回收和分离中应用更多。
沉淀法在生物工程中常用的具体分离方法有：加入中性盐、加入可溶性有机溶剂、将pH值调节到等电点、加入非离子型亲水聚合物、加入聚电解质絮凝、加入多价金属离子等。本文就以等电点沉淀法提取分离牛乳中的蛋白质做详细介绍。
二、沉淀分离操作的一般步骤：
1、加入沉淀剂
2、沉析物的陈化，促进粒子生成
3、离心或过滤，收集沉析物
三、等电点沉淀法
等电点沉淀法主要用于一些两性电解质的产物中，例如：抗菌素（四环素）、氨基酸（谷氨酸）以及一些水化程度不大或憎水性的蛋白质（酪蛋白）。在实际生产应用中，等电点沉淀法有时往往与盐析、有机溶剂沉析等法联合使用。
四、等电点沉淀法的原理
等电点沉淀法的原理是两性电解质在溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的水化层和双电层的削弱或破坏，分子间引力增大，溶解度降低，从而析出。
五、蛋白质能稳定存在的原因。
蛋白质溶液能稳定存在的因素有两个。一是蛋白质表面存在水化层。蛋白质是两性高分子电解质，在水溶液中，疏水性氨基酸折向内部，亲水性氨基酸分布在蛋白质结构的外表面，与水分子结合形成水化层。蛋白质周围的水化层是蛋白质形成稳定的胶体溶液，防止蛋白质凝聚沉淀的屏障之一。二是蛋白质表面存在双电层。蛋白质胶体溶液的pH值偏离蛋白质等电点时，蛋白质的净电荷或正或负，成为带电粒子，在电解质溶液中吸引相反电荷的离子（称反离子），形成双电层,使蛋白质溶解在水中。蛋白质分子间的静电排斥作用是防止蛋白质沉淀的另一屏障。
显然，等电点沉淀法很适合应用到蛋白质的提取分离中。将蛋白质胶体溶液的pH值调至等电点,蛋白质分子表面净电荷为零，水化层被破坏，双电层明显减弱，静电排斥最小，溶解度最低，蛋白质析出。需要注意的是蛋白质的种类不同，其等电点也不同，因此，利用等电点沉淀法时应根据具体沉淀的蛋白质调节溶液的pH值。
六、等电点沉淀法提取牛乳中的蛋白质实验
牛乳中含有丰富的蛋白质其中主要是酪蛋白，约占总蛋白量的5/6。调节牛乳的pH值至4.8，即酪蛋白的等电点时，酪蛋白即沉淀出来。用乙醇除去酪蛋白中不溶于水的脂肪，得到纯的酪蛋白。
所用试剂：新鲜牛乳、0.2mol/ml醋酸—醋酸钠缓冲液、1%NaOH溶液、10%醋酸、95%乙醇、乙醚
操作步骤：
1、酪蛋白的提取
①、去新鲜牛乳10ml放入50ml烧杯中，水浴加热至 40℃；
②、向加热至40℃的新鲜牛乳中加入10ml加热至相同温度的0.2mol/ml醋酸
—醋酸钠缓冲液，摇匀，用pH计测混合液的pH值，调节至4.8（用1%NaOH溶液或10%醋酸调整）；
③、将混合液静置，冷却至室温，继续放置5分钟用细纱布过滤；
④、过滤所得沉淀物用少量蒸馏水洗几次，过滤；
⑤、过滤所得沉淀物即为粗酪蛋白。
2、酪蛋白的纯化
①、将粗酪蛋白放于30ml95%乙醇中洗涤，过滤，用乙醚冲洗；
⑥、将所得沉淀物摊开在表面皿上，使乙醚完全挥发，所得即为酪蛋白；
③、烘干，用电子天平称其质量。
3、产物鉴定
①、酪蛋白含量计算：酪蛋白克数/100mL牛奶
②、所得到的酪蛋白可通过酪蛋白性质进行鉴定，如：利用溶解度、米伦反应等方法。
七、等电点沉淀法应用时应注意的问题：
1、生物高分子的等电点易受盐离子的影响发生变化
若蛋白质结合的阳离子多，如Ca2+、Mg2+、Zn2+时等电点升高；若蛋白质结合的阴离子多，如Cl-、SO42-、HPO42-，则等电点降低。自然界中许多蛋白质较易结合阴离子，使等电点向酸侧移动。
2、在使用等电点沉淀法时，应考虑目的产物的稳定性
有些蛋白质或酶在等电点附近不稳定。如α—糜蛋白酶（pI=8.1-8.9）、胰蛋白酶（pI=10.1），它们在中性或偏碱性的环境中由于自身或其他蛋白水解酶的作用而部分降解失活，所以在实际操作过程中应避免溶液pH值上升至5以上。
3、生物大分子在等电点附近盐溶作用明显
无论是单独使用或与溶剂沉析法合用，都必须控制溶剂的离子强度。
4、等电点沉淀法一般适用于疏水性较大的蛋白质(如酪蛋白)
等电点沉淀法对于亲水性很强的蛋白质(如明胶)，由于在水中溶解度较大，在等电点的pH下不易产生沉淀。
5、等电点沉淀的优点是无需后继的脱盐操作
与盐析法相比，等电点沉淀法的提取物要纯，不需要脱盐操作。但是，如果沉淀操作的pH过低，容易引起目标蛋白质的变性。
