TaqMan探针法SNP筛查中文操作手册

2010-04-24 19:31阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/1734045943

定量PCR仪SNP分型实验简明操作
2 x TaqMan Universal PCR Master Mix
20 x TaqMan SNP Genotyping Kits
1. DNA、引物及探针用量
DNA纯度：OD260 / OD280 = 1.6 ~ 2.0，浓度1 - 20 ng/μL。
引物和探针浓度：
Primer/Probe Mix 贮存液（20 X）工作液（1 X）每反应用量
6-FAM Probe 4 μM 200 nM 5 pmol/Rxn
VIC Probe 4 μM 200 nM
Forward Primer 18 μM 900 nM 22.5 pmol/Rxn
Reverse Primer 18 μM 900 nM
2．PCR反应
试剂用量 (μL)
2 x Universal PCR Master mix (no UNG) 12.5 (1x)
20 x SNP kit (Probe/Primer mix) 1.25 (1x)
DNA (20 ng/μL) 1
H2O 10.25
总体积 25
PCR循环参数：
95 °C 10 min → (92 °C 15 sec → 60 °C 1 min) × 40个循环
3． SDS软件 v1.0操作和数据分析：7000
SNP分型实验包括两步：(1) 40个循环的PCR扩增和(2) PCR后的荧光信号读取（Post-read）。第一步既可以在定量PCR仪（7000、7900等）上，也可以在普通PCR仪上（9700、9600等）进行；第二步则必须在定量PCR仪上进行。如果第一步在定量PCR仪上进行，按实时定量方法操作；第二步按以下步骤操作。
1) 开机
检查电脑与仪器联线是否正常，电脑应处于外接电源供电状态。开电脑，待桌面图标出现后，开7000主机电源，然后启动SDS应用软件。
2) SDS软件操作
• 从File下拉菜单中选New，新建一个空白96孔板文件，注意其中

assay类型选择Allelic Discrimination。
• 双击任意孔，打开Well Inspector窗口。
• 首先新建探针：点击Add Detector按钮，出现Detector Manager窗口；从File下拉菜单中选New，出现New Detector窗口，Name栏取名（FAM与VIC探针分别对应于两种多态或正常与突变基因），Description栏可以填写检测位点和标记情况，报告基团选FAM或VIC，淬灭基团如果是MGB选none，如果是TAMRA选TAMRA，指定颜色（可以是任意颜色），填写完毕后点OK回到Detector Manager窗口；点击Add to Plate Document按钮后，再点击Done按钮关闭窗口，回到Well Inspector窗口。
• 然后新建Marker：在Well Inspector窗口中点击Add Marker按钮，出现Marker Manager窗口，刚才新建的探针出现在该窗口右边的探针列表中；点击Create Marker按钮，出现Create Marker窗
1
口，命名，点OK回到Marker Manager窗口；先在左边的Marker List中选中所要用到的Marker，然后在右边的Detector列表中的Use栏打钩选择所要用到的探针，注意要选择FAM和VIC标记的探针各一，如果只选了一个探针，下一步软件将提示出错：“Please select a valid marker to add to the document”；选好后点击Copy to Plate Document按钮后，点击Done按钮关闭窗口，回到Well Inspector窗口，刚才新建的Marker出现在Well Inspector窗口的Marker列表中，每个Marker在表中占3行。
• 在Well Inspector窗口打开的情况下，选中96孔样品表中有样品的孔使之变成灰色，在Well Inspector窗口的Marker列表中的Use栏方框中打钩选择所要用到的Marker，设定Task的类型为Unknown（样品）或NTC（空白对照）。
• 设定Passive Reference为ROX，点窗口右上角的x关闭Well Inspector窗口。
• 将窗口页面切换到Instrument，无须改动热循环程序，点击Post-Read按钮，读取荧光信号；信号读取只需10秒钟左右。
3) SNP数据分析
• 点击Analyze按钮分析实验结果。
• 切换到Results窗口，再选择Allelic Discrimination子页面，选中样品孔，中间即显示该样品的荧光分布：图谱中的每一个x代表一个样品，X轴代表VIC荧光，Y轴代表FAM荧光，原点处为NTC空白，对角线处为杂合子。
• 如果信号分布规律不明显，可以点放大或缩小按钮，然后鼠标点击Allelic Discrimination图来放大或缩小，调整大小。
• 基因分型方法：点套索工具，然后用鼠标圈定每簇信号，在Call里选择对应的等位基因类别，依次指定FAM纯合子、VIC纯合子、FAM与VIC杂合子和空白对照NTC。
• 在Report子页面中查看基因分型结果列表。注意：如果只指定了部分样品的基因型，Report表中则只显示该样品的基因分型结果，其余的样品仍然显示为Undetermined。
4. 相关试剂
1. TaqMan Universal PCR Master Mix，No AmpErase UNG：试剂原液为2倍浓度，标准体积200反应/kit，P/N 4324018。
2. TaqMan SNP Genotyping试剂盒：试剂原液为20倍浓度，含2条引物和2条探针，探针分别以FAM和VIC标记，涉及全部重要的人类SNP位点，目前共有160000多个试剂盒，而且试剂盒的数量每天都在增加。请通过www.appliedbiosystems.com查询。此试剂盒的价格比国内合成的MGB探针更便宜。
3. Assays-by-Design服务：用户提供序列并指定位点，ABI设计、合成并测试引物和探针，每个位点提供经过优化的单管试剂盒。
(Last Revised: 2004-05-10)
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