RT-PCR操作步骤与方法
1、转移1 pg~100 ng的poly(A)+RNA或者10 pg~1 μg的总RNA到一只新的离心管。用水调整体积到10 μl；将RNA样品在75℃变性5 min，将离心管迅速插入冰中冷却。
2、将含有这种变性的RNA样品的离心管内依次加入如下试剂：10×扩增缓冲液2 μl，20 mmol/L 4种dNTP混合液（pH8.0）1 μl，引物（最优）1 μl，约20单位/μl 胎盘RNase抑制剂1 μl，50 mmol/L MgCl2 1 μl，100~200单位/μl反转录酶1 μl，H2O补足到20μl。温育在37℃反应60 min。MgCl2为反转录酶所必需。
注意：引物与模板的最佳比例对于每一批制备的RNA样品是应该通过预实验来确定的，推荐在20 μl反应体系加入如下范围的引物量来筛选：与靶RNA互补的寡核苷酸5~20 pmol/L，oligo (dT)12~18 0.1~0.5 μg，随机六核苷酸1~5 μg。cDNA合成通过测定放射性物质的掺入量比例来确定，因为反应在反转录反应中加入了含[32P] dCTP（10~20 μCi）的放射性底物（放射性比活度为3000 Ci/mmol）。第一链cDNA分子大小能通过碱性琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
设置3支阴性对照管。在一支对照管中加入合成第一链cDNA反应所需的所有试剂，但不加模板RNA；第2支对照管中加入除了反转录酶外的所有试剂；第3支对照管加入除了引物外的所有试剂。在这些照管进行所有后续的实验步骤。设置这些对照管能保证反转录酶产物不是由于污杂或RNA的自身引导所致。
尽可能设置阴性对照管。阴性对照管用外源参考RNA作模板，而它的引物的结合位点最好与靶RNA模板的结合位点是相同的。有时，依据一种外源DNA序列正义和反义引物结合位点而扩增产生的合成序列，常常能产生一种合适的参考模板；然后，这种克隆能体外转录出RNA模板，而后者可作为RT-PCR的阳性对照。
3、将反应管在95℃加热5 min。使反转录酶失活和RNA-cDNA杂合物变性。
样品反转录后，反应液中的反转录酶必须使之失活，才能使RT-PCR的扩增阶段能有效地合成产物。有时，反转
1、转移1 pg~100 ng的poly(A)+RNA或者10 pg~1 μg的总RNA到一只新的离心管。用水调整体积到10 μl；将RNA样品在75℃变性5 min，将离心管迅速插入冰中冷却。
2、将含有这种变性的RNA样品的离心管内依次加入如下试剂：10×扩增缓冲液2 μl，20 mmol/L 4种dNTP混合液（pH8.0）1 μl，引物（最优）1 μl，约20单位/μl 胎盘RNase抑制剂1 μl，50 mmol/L MgCl2 1 μl，100~200单位/μl反转录酶1 μl，H2O补足到20μl。温育在37℃反应60 min。MgCl2为反转录酶所必需。
注意：引物与模板的最佳比例对于每一批制备的RNA样品是应该通过预实验来确定的，推荐在20 μl反应体系加入如下范围的引物量来筛选：与靶RNA互补的寡核苷酸5~20 pmol/L，oligo (dT)12~18 0.1~0.5 μg，随机六核苷酸1~5 μg。cDNA合成通过测定放射性物质的掺入量比例来确定，因为反应在反转录反应中加入了含[32P] dCTP（10~20 μCi）的放射性底物（放射性比活度为3000 Ci/mmol）。第一链cDNA分子大小能通过碱性琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
设置3支阴性对照管。在一支对照管中加入合成第一链cDNA反应所需的所有试剂，但不加模板RNA；第2支对照管中加入除了反转录酶外的所有试剂；第3支对照管加入除了引物外的所有试剂。在这些照管进行所有后续的实验步骤。设置这些对照管能保证反转录酶产物不是由于污杂或RNA的自身引导所致。
尽可能设置阴性对照管。阴性对照管用外源参考RNA作模板，而它的引物的结合位点最好与靶RNA模板的结合位点是相同的。有时，依据一种外源DNA序列正义和反义引物结合位点而扩增产生的合成序列，常常能产生一种合适的参考模板；然后，这种克隆能体外转录出RNA模板，而后者可作为RT-PCR的阳性对照。
3、将反应管在95℃加热5 min。使反转录酶失活和RNA-cDNA杂合物变性。
样品反转录后，反应液中的反转录酶必须使之失活，才能使RT-PCR的扩增阶段能有效地合成产物。有时，反转