四种测序方法对比及Sanger测序的优势
2016-03-03 15:16阅读：
1、二代测序和Sanger测序方法有两点不一样（见下表）：
（1）二代测序法是将基因组DNA随机切割成小片段DNA分子，然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库，获得测序模板；
（2）用大于Sanger测序几十倍的成数进行小片段测序，然后根据重叠的部分用软件自动寻找组装拼接。
2、造成二代测序实验结果的偏差的原因：
（1）建库环节非常容易出现污染（对实验室要求很高）；
（2）无限倍扩大、扩增过
程中由于不同基因的偏好性，会
失真会偏差；
（3）二代测序100bp，短片段拼接，会拼错位置，Sanger测序长度800bp无需拼接；
（4）对比、分析、推理、出报告环节，会掺入人为的主观臆断。
3、一代芯片测序在标记、杂交环节容易出问题：
电子信号识别会把没有杂交上去的失败实验判定为阴性，由于样品问题和操作问题可能会出现较大假性结果概率，同样像二代测序一样有对数据进行对比、分析、推理、出报告的环节，带进主观臆断成分，造成实验结果可重复性不高。
4、三代测序技术原理科学但技术很不成熟，现在还不能用。
5、Sanger测序由于是直接测序，二代测序和一代芯片测序不准确的因素不会发生。
6、Sanger测序的优势：
（1）精准：流程细致，质控环节多，污染低，结果直观可视，假性结果极低。
（2）可进行个性化位点检测，可以任意选择单项测序，Sanger测序个性化基因检测有价格优势。由于临床测序特点是：“目标明确、结果精准、通量小”，Sanger
测序非常适用于临床。
三博基因公司常年承接新一代测序验证工作，二代测序和一代芯片测序有时失真很厉害，客户反映：“大量测序二代便宜，但有时物种都会搞错，只好用Sanger测序重头再重测”。有的用二代测序筛查遗传病，查不出问题，返回来找一代Sanger测序重测。有的公司用一代芯片做大套餐的易感基因检测，结果非常雷同，检测不出什么实质问题。
二代芯片重复性不高的案例：我们曾把同一个人的样品，寄到23andme和国内XXX公司，做同样套餐项目（两家用同样的仪器，相同测序技术、同样的检测内容），对比其结果相似性只有60%左右，而一代Sanger测序结果一般和预期是一致的。
美国23andMe公司使用的
Illumina公司的Solexa测序平台，
2013年11月份被叫停，2015年，美国FDA依旧没有解除对23andMe的限制，理由是“疾病检测具有一定风险，万一检测失误，人们由于恐惧将来会得乳癌，就切除了乳房。人们的健康损失、谁来担此责任？都成了不得不考量的问题。既然是医疗设备，就要受到监管……”
Sanger测序与其他测序方法流程、准确度对比表
