包涵体蛋白纯化——SOP
2018-10-23 12:41阅读：
包涵体蛋白纯化
1）包涵体蛋白的获取
(1)从半固体培养基平板上挑取一个表达菌单集落，加入2ml含有相应抗生素的LB培养基37培养活化过夜；
次日，2L培养瓶加入1L含相应抗生素LB培养基，接种1ml活化好的表达菌，
37振摇条件下培养至A600nm=0.6;
(2)加入异丙基β-D-硫化半乳糖苷(
IPTG)至0.5～1
mM，诱导目的蛋白表达；
(3)诱导3～4h后，15
000 r/min离心15
min收获细胞，用小体积的培养上清液重悬细胞，然后将其转移至预先称重的50
ml
离心管中，离心沉淀细胞。记录细胞沉淀的湿重，并冻存于-80备用。
用此方法一般每升可得到1.5～2.0g湿重的大肠杆菌细胞。
(4)裂解细胞，用30
ml裂解缓冲液[50 mM
Tris-HCl ( pH7.9 ), 0.1 mM
EDTA,5%甘油，0.1mM DTT,0.1M
NaCl]悬浮细胞，超声波破碎细胞至清亮（冰上操作，
60%功率4次，每次20秒，间隔1min）
（5）加入纯Triton
X-100至终浓度为1%，吹打或者轻度超声以溶解和洗涤细胞膜蛋白；裂解物于冰上静置10min，然后15000r/min
离心15min沉淀包涵体，弃上清。
（6）加入30ml含1%
Triton
X-100的裂解缓冲液洗涤包涵体，吹打或者轻度超声，冰上静置10min，然后15000r/min
离心15min沉淀包涵体，弃上清。
（7）加入30ml裂解缓冲液洗涤包涵体，吹打或者轻度超声，冰上静置10min，然后15000r/min
离心15min沉淀包涵体，弃上清。此时,包涵体纯度达到90%左右。
2）包涵体蛋白的溶解
（8）将洗涤后的包涵体重悬于合适的变性缓冲液,使其变性和溶解;变性之后15000r/min离心15min去除残余不溶物。
注：通常使用的变性缓冲液以裂解缓冲液为基础溶液，加入6M盐酸胍，8M尿素或者0.3%十二烷基肌氨酸钠等，变性和溶解的时间根据包涵体的性质确定，上文已经提及。
3）包涵体蛋白的复性
（9）将变性的包涵体蛋白浓度调整到1mg/ml;
(10)将包涵体蛋白滴加到快速搅拌的重折叠缓冲液中使其复性，滴加的第（9）步骤包涵体溶液的体积不超过溶液总体积的1/15。滴加完之后，静置2h以上。
4）包涵体的纯化
(11)
步骤(10)的包涵体溶液15000r/min
离心15min弃除不溶物，或者低吸附0.22um过滤器过滤。包涵体的纯化可以选用合适的离子交换柱进行，上柱子尽可能快速，如果选用15ml柱子，复性蛋白上柱速度至少在10ml/min,必要时使用蠕动泵。
（12）
用5～10倍体积的洗涤缓冲液[0.1M
NaCl,50mM Tris-HCl(pH7.9),5%甘油，0.1mM
EDTA,0.1mM
DTT]冲洗柱子,之后用10个体积的洗脱缓冲液【整个过程中，匀速将上述洗涤缓冲液中NaCl浓度从0.1M逐渐升到1M】,梯度洗脱流速为5ml/min,每3ml左右收集一管。整个过程中检测280nm吸光值，如果有条件同时检测320nm吸光值【320nm吸光值可能为多聚体】。
5）包涵体蛋白的鉴定与保存
（13）SDS-PAGE分析各个收集管的蛋白纯度；
如果能够做酶活性分析的，对收集的各个组分做酶活性分析，
如果有该蛋白标准品，可以通过标准酶活作酶活定量分析。
（14）蛋白样品保存：包涵体蛋白用含50%甘油的裂解缓冲液，-20或-80分装成小管保存。
SOP9 Ni-NTA
Beads亲和层析纯化6His融合标签包涵体蛋白
1）样品制备：包涵体蛋白样品
（1）将诱导表达结束后的培养物转移到离心管中，8,000rpm，离心15min收集菌体，然后加入1/10体积的裂解缓冲液（50
mM NaH2PO4，300 mM
NaCl，10 mM imidazole pH
8.0，1mM PMSF)
,加入0.2～0.4mg/ml溶菌酶。
PMSF很容易降解,在破菌前加入,同时还可加入不影响目的蛋白与树脂结合的蛋白酶抑制剂。
(2)将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，也可考虑加入10μg/ml
RNase A和5μg/ml DNase
I），混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞。
3)
将破碎液转移至离心管中，10,000rpm，4离心20～30min，去掉上清,沉淀为包涵体。
4)步骤2）和3）可以重复一次。
5)按照原菌体:包涵体溶解缓冲液（50
mM NaH2PO4，300 mM
NaCl，10 mM
imidazole，8M尿素，pH
8.0）=1:10(W/V)将包涵体悬浮溶解，此为包涵体溶液。
包涵体溶液可用于变性条件下His标签蛋白的纯化。
2.样品纯化
纯化方法与“上清可溶性表达重组蛋白的纯化”章节His标签融合蛋白Ni-NTA的纯化方法完全相同，不同点在于纯化过程所有溶液都在上述实验基础上都添加8M尿素。
