多肽完全抗原的制备——SH以及GA介导多肽与载体偶联
2018-10-23 14:44阅读：
多肽完全抗原的制备
多肽的设计需遵循第二章所阐述的多肽抗原设计原则，如果设计上没有把握可以委托多肽合成公司协助设计（多肽合成服务公司一般都有资深多肽设计专家）；委托合成时，根据项目特点确定需求量和纯度；产品交付时，服务公司会提交质检报告，质检报告包括HPLC数据和质谱报告。
蛋白修饰性抗体我们一般通过多肽合成的方式制备抗原，因为蛋白修饰的只有通过化学合成才能做到其位点确认被修饰，常见的修饰有磷酸化、乙酰化、甲基化等修饰；这些修饰大部分的多肽合成公司都可以合成。
多肽不可以直接作为抗原免疫产生抗体，需要偶联到蛋白质载体上形成完全抗原，常用的载体主要是KLH（血蓝蛋白）和BSA（牛血清白蛋白）。
多肽偶联最常用方案：-SH偶联（通过Sulfo-SMCC试剂介导,合成时需要在多肽的N-端或者C-端加上一个Cys引出一个游离的-SH）和-COOH/-NH2偶联（通过NHS/EDC或者EDC介导交联）；-SH
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多肽与蛋白偶联的方法和技术很多，不是专门研究有机化学的科研人员往往不知如何入手，为此福因德生物优化了部分偶联试剂和偶联方案，遴选一部分产品供科研客户选购。
SOP10 Frdbio
–SH介导多肽与载体偶联
1.
cKLH载体蛋白与sulfo-SMCC的偶联
（以偶联20mg多肽为例，根据实验实际偶联量，所有试剂体积作同比缩放）
1）称取20mg
cKLH（Frdbio，Cat
No.:
BCJ0002），溶于2ml超纯水，配成【10
mg/ml
cKLH溶液】。
2）称取10 mg
Sulfo-SMCC(Frdbio)于2ml超纯水配成【5mg/ml
Sulfo-SMCC溶液】。
3）将以上两种溶液等体积混匀，室温(25)反应60
min或者37反应30
min，磁力搅拌器慢速均匀搅动反应，避免产生气泡。
4）反应完后将以上反应溶液装入10kD透析袋，在PBS（pH7.2）溶液中透析除去过多Sulfo-SMCC，每隔3h换液，至少换3～4次，确保透析完全，即为【活化的cKLH载体】（有条件的也可以用sephdex-G25分子筛色谱分离或超滤管）。活化的cKLH要尽快使用，不可久放。
2.多肽的偶联
偶联前需检测多肽中-SH活性。
1）
Ellman试剂法检测多肽-SH状态:
方法：在96孔酶标板中，10μl多肽
100μl
Ellman试剂，用分光光度计在96孔酶标板中412nm进行测量，
OD＞0.15时，多肽SH正常，如果OD＜0.15，说明多肽被氧化或者自我交联，不可使用。偶联完成之后，透析前用上述同样方法检测DO＜0.03时，说明多肽已经80%以上全部偶联，可继续添加多肽；如果OD＞0.03，说明多肽过量未全部偶联。如果没有Nano分光光度计，直接观察颜色，颜色变黄，说明游离—SH过量。
2）多肽与载体的偶联
5）称取20mg多肽溶解于5ml交联缓冲液(0.1M
PB，0.15M
NaCl)中，配成【4mg/ml的多肽溶液】（对于难溶肽，可用≤30%的DMSO溶解），一般我们只偶联5～10mg多肽，等比例缩小体积即可。
6）将第4步透析好的cKLH与第5步配好的【4mg/ml多肽溶液】混合，室温(25)4h。（此处可检测多肽是否偶联充分，检测方法见3
Ellman试剂法检测多肽-SH状态）
7）最后用10kD的透析袋于PBS（pH7.2）中透析除去游离未偶联的多肽，至少换液4次。每次2h，磁力搅拌器上搅拌透析，调整到合适浓度分装成小管，-20保存。
3．Ellman试剂检测多肽-SH状态评估载体与多肽偶联效率
方法见“1）
Ellman试剂法检测多肽-SH状态”。
SOP11
Frdbio
EDC或EDC/NHS介导多肽与载体偶联
1）将载体蛋白cKLH（Frdbio，Cat
No.: BCJ0002）
溶解在偶联缓冲液（0.1M
MES，pH4.7），终浓度10mg/ml。
2）将待偶联多肽溶解在偶联缓冲液(0.1M
MES，pH4.7)，终浓度4mg/ml。
3）将步骤1)和步骤2）的溶液混合，多肽与载体蛋白摩尔比为10:1。
4)将EDC试剂（Frdbio）溶解在偶联缓冲液(0.1M
MES，pH4.7)中配制成1M
EDC溶液。
5)步骤3)的混合液在磁力搅拌下，缓慢滴加步骤4）的EDC溶液（EDC滴加的摩尔量与多肽相同），置25磁力搅拌反应2h。
注：如果此过程中，产生沉淀应该减少EDC的用量直到得到可溶性溶液为止。
6）透析或凝胶过滤去除未偶联的多肽和EDC试剂，并置换成PBS溶液(0.01M
PBS,pH7.4)。
注：NHS与EDC可以显著提高偶联效率，如果采用此方案，只需要在步骤5）中加入NHS至终浓度为5mM即可。
SOP12 Frdbio GA(
Glutaraldehyde,戊二醛)介导多肽与载体偶联
1）将含氨基的载体蛋白溶解在偶联缓冲液（0.1M
碳酸盐，0.15M
NaCl，pH8.5），终浓度2mg/ml。
2）将待偶联多肽溶解在步骤1）的溶液中，终浓度2mg/ml左右，多肽与载体蛋白摩尔比例20:1～40:1最好。
3）在上述溶液中加入新鲜GA至中浓度为1%，4磁力搅拌器上反应2～4h。
注意：戊二醛最好在通风橱操作，避免接触皮肤和眼睛。
1）
反应完毕，在上述溶液溶液中加入硼氢化钠至终浓度为10mg/ml,
4磁力搅拌器上反应1h。
透析或凝胶过滤去除未偶联的多肽和GA试剂，并置换成PBS溶液（0.01M
PBS,pH7.4）。
