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血红蛋白的提取和分离

2010-12-14 19:17阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/1892723095

蛋白质的提取和分离分为四步：样品处理、粗分离、纯化、和纯度鉴定。
（一）样品处理：血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞中，约90%是血红蛋白。血红蛋白因为含有血红素而呈现红色。
1. 红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，用离心机进行分离。采用低速短时间离心，如500r/mim离心2mim，用胶头滴管吸出上层透明液体（黄色血浆），将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯中，再加入五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液），缓慢搅拌10mim，低速时间离心，如此重复洗涤三遍，直至上层清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
2. 血红蛋白的释放：将洗好的红细胞倒入烧杯中，加入蒸馏水到原血液的体积，再加入40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10mim。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
3. 分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液转移到离心管中，以2000r/mim的速度离心10mim后，可以看出溶液分为4层，从上往下数，第一层是无色透明的甲苯层，第二层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层，第三层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，出去脂溶性沉淀物，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体
4. 透析：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲剂中（pH为7.0），透析12h。
注意：为了防止血液凝固，在采血容器中药预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，比例是每100mL血液加入3.0g柠檬酸钠。
透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的。透析袋能使小分子只有进出，而将大分子保留在袋内。透析可以出去样品中小分子的杂质，或用于更换样片的缓冲液。洗涤次数过少，无法出去血浆蛋白；离心速度过高或时间过长会使白细胞等一起沉淀，达不到分离的效果。此实验用的是猪牛羊或其他脊椎动物的血液来分离的。

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