预装层析柱、常用填料的使用维护
2013-04-18 22:22阅读：
1/Superdex 75Superdex
75 10/300 GL , Superdex 200
10/300
GL
的使用及维护 Superdex
系列层析柱的选择
•根据待分离样品分子量的大小不同进行选择：
•Superdex 75
分离范围：3000～70000（球蛋白）；
•Superdex 200
分离范围：10000～600000（球蛋白）；
•如果是分离范围重合的组分，则优先使用分离范围窄的填料；
•缓冲液的准备：
缓冲液及样品的要求
所有缓冲液必须经过0.45um
滤膜过滤后方可使用；•样品的准备：
1.样品蛋白总量应控制在10mg以下
2.样品体积推荐控制在500ul左右
3.样品必须经过0.45um滤膜过滤或者10000g离心10min后方可上样
禁止使用以下缓冲液•使用氧化剂将破坏层析填料的化学结构，造成填料报废；
•使用未过滤的溶液将引起层析柱堵塞导致柱反压升高而使层析柱无法正常使用（如果发现此种情况请联系维护人员更换柱内滤片）
操作流速及压力
•推荐流速：
Superdex 75
10/300 GL 及Superdex 200
10/300 GL 推荐使用0.5ml/min
•使用压力：
不超过1.5MPa，15bar，218psi；
Superdex 75 10/300 GL
and Superdex 200
10/300 GL 的保存
应使用脱气后的20％乙醇保存，并置于4～30°C范围的恒温环境
Superdex 75 10/300 GL
and Superdex 200
10/300 GL 使用维护流程小结
1.所有使用缓冲液的脱气、过滤；
2.样品过滤或者离心；
3.层析柱的连接，应防止气泡进入；
4.层析柱连接后应使用不少于半个柱体积（层析柱体积为24ml）的去离子水（经脱气）冲洗，防止高盐缓冲液和乙醇接触而产生沉淀；
5.层析柱使用结束后也同样应使用去离子水（经脱气）冲洗不少于半个柱体积后再用20％乙醇保存；
离子交换填料的使用和维护
•按照其所带的交换功能基的特性可以分为阳离子交换填料（SP、CM）和阴离子交换填料（Q、DEAE）；
离子交换填料的种类
•按照功能基上酸或碱的强弱程度分为强酸阳离子交换树脂（SP）、弱酸阳离子交换树脂（CM）；强碱阴离子交换树脂（Q）、弱碱阴离子交换树脂（DEAE）;
离子交换填料的选择
•离子交换填料的选择首先应考虑保持欲分离物质的生物活性，以及在不同PH环境中此物质所带的电荷和电荷的强弱；
•例如polymyxin、
cytochrome
C这些碱性蛋白质，它们在酸性溶液中比较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换填料；其它像heparin、nucleic
acid这类酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换填料；
•如果要分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH范围带有何种电荷，作为离子交换填料的选择。以胰岛素（insulin）为例，它的等电点为pH
5.3，因此在pH<5.3（酸性）溶液中，因带有正电荷，故采用阳离子交换填料，在pH>5.3的碱性溶液中，带有负电荷，使用阴离子交换填料。
常用离子交换填料的流速、压力
常用的离子交换填料包括：
SP-Sepharose、CM-Sepharose、
Q-Sepharose、DEAE-Sepharose
使用流速：
最大流速750cm/h
：
2(内径16mm层析柱截面积)X750/60min＝25ml/min
使用压力：
最大耐压0.3MPa、3bar、44psi
常用离子交换填料的载量
缓冲液及样品的要求
缓冲液的准备：
所有缓冲液必须经过0.45um滤膜过滤后方可使用；
样品的准备：
样品必须经过0.45um滤膜过滤或者10000g离心10min后方可上样
禁止使用以下缓冲液
使用氧化剂将破坏层析填料的化学结构，而使填料报废；
使用未过滤的溶液将引起层析填料污染，影响填料性能；
离子交换填料的再生
去除一般杂质使用2M NaCl
3CV(column volume)；
去除沉淀蛋白、疏水蛋白、脂蛋白使用 1M
NaOH 3CV
并保持接触30min；
去除强疏水蛋白、脂质可以使用70％乙醇或者
30％异丙醇；
同一蛋白使用5～10次清洗一次（保护填料），使用不同蛋白则每次都需清洗（防止交叉污染）；
离子交换填料再生后处理
清洗后应当用去离子水把填料冲洗干净（到流出PH到中性）后，如果不再使用应保存于20％乙醇，如需再次使用则用buffer再次平衡；
离子交换填料的保存
1.未使用过的新填料的保存：
置于4～30度保存；
2.已使用过填料的保存：
在20％乙醇中置于4度保存；
离子交换填料使用简易流程
A. 3CV去离子水冲洗填料
B. 5～10CV Elution
Buffer（含高盐）平衡（应测流穿PH及OD280基线稳定）
C. 3CV Start Buffer
（不含盐或含低盐）(测流穿PH)
D. 进样（样品电导不得高于Start
Buffer）
E. 洗涤
(一般为Start Buffer)
5～10CV（至OD280基线稳定）
F. 洗脱 Elution
Buffer(含高盐)线性梯度洗脱或者分步洗脱
G. 再生
H.
去离子水清洗10CV
I.
20％乙醇5CV
J. 保存
（4度）
K.
所有溶液都应经0.45um滤膜过滤方能使用；
3.Ni-NTA填料的使用和维护
Ni-NTA Agarose
操作流速、压力、载量等
推荐流速：
100cm/h=
2(16mm内径柱截面积)X100/60min＝3.3ml/min
使用压力：
重力，此填料不耐压（最大耐受压0.2bar、2.8psi）
载量：
分子量20KDa的样品5～10mg/ml
Ni-NTA Agarose
在各种缓冲液中的稳定性
鳌合剂：EDTA、EGTA，最高1mM（Ni
脱落）
还原剂：B-巯基乙醇，最高20mM；不推荐使用DTT、DTE（最高1mM）
变性剂：Urea
最高8M；Gu-HCl，最高6M；
其他试剂：
NaCl，最高2M，推荐0.3M用于防止离子吸附；
imidazole，低浓度20mM用以防止非特异性吸附，100mM以上通常用于洗脱目标蛋白；
禁止使用以下缓冲液
使用氧化剂将破坏层析填料的化学结构，而使填料报废；
使用未过滤的溶液将引起层析填料污染，影响填料性能；
缓冲液及样品的要求
缓冲液的准备：
所有缓冲液必须经过0.45um滤膜过滤后方可使用.
样品的准备：
样品必须经过0.45um
