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iTRAQ实验技术和SILAC实验技术

2012-07-24 09:30阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/2083726880

iTRAQ实验技术(资料来自广州辉骏生物科技公司)
一、iTRAQ概述
iTRAQ (Isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）定量蛋白质组学是蛋白酶切后形成多肽，用iTRAQ同位素试剂标记多肽N末端或赖氨酸侧链基团。标记后的肽段经过液相分离，进行一级质谱和二级质谱分析，在二级质谱前，被标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比和其他理化性质。而在二级质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114～121)的峰，根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。

二、iTRAQ试剂结构

iTRAQ实验技术和SILAC实验技术

图1：iTRAQ试剂包括三部分：报告部分、肽反应部分、平衡部分。1、报告部分有八种：114-121，因此iTRAQ试剂可同时标记8组样品。2、肽反应部分：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接而标记上肽段。3、平衡部分：保证被标记的同一肽段的质荷比相同。

三、与传统的双向电泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技术服务优势
1、灵敏度高，检测限低，可检测出低丰度蛋白；
2、分离能力强，分析范围广，iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白；
3、高通量：同时对8个样本进行分析，提高了实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析；
4、结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠；
5、自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。

四、iTRAQ技术服务流程
iTRAQ实验技术和SILAC实验技术
图2：iTRAQ技术服务流程。1、样本经过不同处理后提取蛋白质；2、蛋白质经过还原，封闭后胰蛋白酶酶切；3、肽段混合物分别用不同的iTRAQ试剂标记；4、等量混合各种iTRAQ试剂标记的肽段；5、MS/MS质谱检测及分析。

五、iTRAQ技术服务内容：
1、样本制备与定量；iTRAQ试剂标记；
2、液相分离和质谱分析；数据库检索；
3、蛋白质定量分析；
4、相关生物信息分析；
5、实验报告提交。

六、送样须知
1、技术咨询：在您开始实验之前，将竭诚为您提供最有效的iTRAQ技术服务方案。
2、为了保证iTRAQ实验能顺利进行，样品寄送需满足以下要求：
基本要求：iTRAQ试剂可以标记任何类型的样本，如组织、细胞、细菌等材料。因此本公司接受任何类型的样本，对于不同的样本需要的量有所不同，具体需要量请咨询本公司。
运输要求：液氮或干冰保存寄送，广州本地客户可上门收样。
注：样本应避免各类污染和反复冻融。

七、iTRAQ实验服务报告内容
1、蛋白定鉴定和定量分析结果；
2、顾客指定蛋白质对应的质谱峰图；
3、实验完整的实验步骤、使用仪器、软件检索参数等。

八、iTRAQ实验服务案例
iTRAQ实验技术和SILAC实验技术

iTRAQ实验技术和SILAC实验技术
图3：iTRAQ定量分析结果。蛋白质样品经过四种iTRAQ（114-117）试剂标记后，质谱分析，每一质谱峰面积代表同一蛋白质不同处理的表达丰度；差异蛋白的生物信息分析。

九、实验服务周期及收费标准：

十、质量承诺：
1、将为您提供严谨的iTRAQ实验设计方案。
2、提供客观的iTRAQ实验分析结果。

SILAC实验技术(资料来自广州辉骏生物科技公司)
一、SILAC概述
SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，其基本原理是分别采用含有轻、中或重型同位素必需氨基酸的培养基培养细胞（用于SILAC的稳定同位素氨基酸主要有Lys和Arg），新合成的蛋白质即嵌合了同位素氨基酸，如此培养5-6代后，细胞的所有蛋白质均被同位素标记上。经处理因素刺激后，等量混合各类型蛋白质，然后经SDS-PAGE分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中同位素峰型的面积大小进行相对定量，同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。
由于SILAC标记技术是体内标记技术，几乎不影响细胞的功能，同时灵敏度高，因此其在蛋白质组学相关领域中得到了广泛的应用，如比较蛋白质组学，蛋白质与蛋白质相互作用，蛋白质与DNA相互作用，蛋白质与RNA相互作用等领域。

二、与体外标记技术相比，SILAC属于体内标记，具有以下技术优势
1、高通量，可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质；
2、定量精确，降低由于样品制备不同而造成的实验差异；
3、线性定量范围广；
4、灵敏度更高，蛋白质需要量明显减少；
5、标记采用的是体内标记技术，更接近样品真实状态。

三、SILAC技术服务流程

iTRAQ实验技术和SILAC实验技术
图1：SILAC技术服务流程。1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加同位素型Lys(D4或 13C6 15N4)、Arg(13C6或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”；2、细胞处理，如药物处理；3、细胞裂解、提取蛋白质；4、等量混合对照组与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳分离、染色；5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，LC-MS/MS质谱分析。

四、SILAC技术服务内容
1、细胞同位素标记；（公司出售L、M和H型同位素Lys和Arg）
2、样本制备与定量；
3、SDS-PAGE分离；
4、胰酶酶切后液相分离和质谱分析；
 5、数据库检索及蛋白质定量分析；
6、差异蛋白的生物信息学分析
7、实验报告提交。

五、送样须知
 1、

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