图1：肾上腺素受体结构 (改自 Scientific Background on
the Nobel Prize in Chemistry 2012)
左侧未与肾上腺素结合的肾上腺素受体AR（蓝色）处于未被激活状态
上世纪80年代，b2肾上腺素能受体的蛋白被成功分离后，Lefkowitz实验室试图鉴定编码b2肾上腺素能受体的基因，在那时Kobilka加入了Lefkowitz的实验室。Kobilka成功克隆了编码仓鼠和人类b2肾上腺素能受体的基因，并发现b2肾上腺素能受体含有7个a螺旋，该结构与视网膜中负责感应光的视紫质（rhodopsin）的结构相类似，从而第一次将光能感应和激素感应的受体直接联系起来(Dixon,
Kobilka et al. 1986; Kobilka, Dixon et al. 1987)。
Lefkowitz以及其研究小组认为b2肾上腺素能受体和视紫质蛋白同属于一个尚未发现的蛋白家族，该蛋白家族以7个a螺旋为标志，并可能大部分都可偶联G蛋白。这一推断很快得到Lefkowitz自己实验室和其他实验室克隆的一系列受体所证实，揭示了包括很多孤儿受体在内的800~1000个成员的GPCR信号转导超家族，从而改变了早期化学家们只能通过合成与天然荷尔蒙或神经传递素结构相类似的分子来制造G蛋白偶联受体药物的局面。
在纯化和克隆b2肾上腺素能受体的同时，Lefkowitz及其小组成员也对受体工作的原理展开研究。通过同位素标记的配体结合等实验，Lefkowitz提出配体-受体-效应器相互作用的三级复合物模型，阐明磷酸化，GRK和Arrestin介导的受体脱敏的机制，并于近年来发现了非G蛋白依赖的Arrestin介导的信号途径。
Kobilka在创建自己的实验室后，为进一步阐明GPCR的工作原理，独立奋斗了15年，找到了通过抗体结合和在受体细胞内第三环中插入溶菌酶，从而使大部分低丰度的扩散型配体的GPCR可以结晶的方法(Rosenbaum,
Cherezov et al. 2007)。
进而，Kobilka于2011年解析了b2肾上腺素能受体与G蛋白三聚体复合物的晶体结构，第一次在原子分辨率阐明了GPCR参与信号转导的机制(Rasmussen,
DeVree et al.
2011)。Lefkowitz和Kobilka的工作从根本上改变了人类对GPCR受体和跨膜信号传递的认识，对现代药物设计的方式有重要影响。
图2：通过放射性标记G蛋白偶联受体图A：碘-125标记的ACTH与肾上腺抽提物的结合情况（改自Lefkowitz, Roth et
al.,
1970），洗脱体系中仅有碘-125标记的ACTH（左图）或为碘-125标记的ACTH、未标记的ACTH与肾上腺抽提物的结合情况
1 标记并分离纯化扩散型配体（diffusive
ligand）的GPCR
在Lefkowitz的工作之前，人们在1870就发现了对光敏感的视紫质(rhodopsin)，并在1933年由George
Wald发现了视紫红质，获得了1967年的诺贝尔奖，但从没有人把感光系统与体内激素的生理作用联系起来。受体的理论也早在20世纪初由Langley和Hill提出并描述，并在1920~1970年这半个世纪得到充分发展，然而受体本身是什么物质依然是一团疑云，充满争论。
随着Sutherland在六十年代发现cAMP在激素响应中的重要作用，很多人也认为腺苷酸环化酶就是受体，以至于1971年Sutherland在诺贝尔奖的演讲中，还提到激素也可能就是作用在腺苷酸环化酶（AC）上，这已经是Lefkowitz证明受体和腺苷酸环化酶（AC）是分开的物质一年以后了。
图3：GPCR基因的克隆 图A：根据克隆所得的人类2AR基因序列得到的氨基酸序列以及跨膜区域（Kobilka, Dixon et
al., 1987）。图B：随后Lefkowitz实验室克隆的GPCR。图C：继而Axel和Linda
Buck克隆的嗅觉受体
Lefkowitz的科学生涯起源于上世纪60年代末，作为医生的Lefkowitz加入了NIH的医生研究实习计划，开始用同位素标记一些激素。1970年，Lefkowitz使用放射性碘-125标记促肾上腺皮质激素（ACTH），发现了与促肾上腺皮质激素具有一定亲和力的受体物质，而具有生物活性的未被碘-125标记的促肾上腺皮质素可以抑制碘-125标记促肾上腺皮质激素与受体的特异结合(Lefkowitz,
Roth et al. 1970)。
根据这些实验结果，Lefkowitz使用促肾上腺皮质激素受体检测血浆中促肾上腺皮质激素受体的含量，建立了一套快速灵敏检测血浆中具有生物活性肽类激素的新方法(Lefkowitz,
Roth et al.
1970)。同年，Lefkowitz关于钙离子对促肾上腺皮质激素的激活作用的研究表明促肾上腺皮质激素受体存在，激素受体的结合与腺苷酸环化酶的激活是两个独立的过程(Lefkowitz,
Roth et al. 1970)。
这些结果表明细胞的表面具有可与细胞外激素结合的受体，但那时依然存在着质疑，怀疑者认为促肾上腺皮质素和去甲肾上腺素所结合的受体很可能是腺苷酸环化酶。
Lefkowitz随后将他的研究转向到具有重大生理学意义的肾上腺素和去甲肾上腺素，尝试发现肾上腺素受体。1971年，Lefkowitz通过使用放射性H-3标记的去甲肾上腺素（norepinephrine），证明在狗心室心肌组织8,000
g离心的微粒体（78,000 g microsomal
fraction）中可能存在肾上腺素的受体（实验表明，与之前促肾上腺皮质激素与受体结合相类似，与去甲肾上腺素相类似的儿茶酚胺类物质可竞争性阻断去甲肾上腺素与受体的结合）(Lefkowitz
and Haber 1971)。
1972年，Lefkowitz使用去污剂显著提高了b2肾上腺素能受体蛋白的可溶性，并在此基础上首次制作了亲和层析柱，将琼脂糖的侧链上人工加入一个长度为30-A的糖链，并通过该链将琼脂糖与去甲肾上腺素偶联(Lefkowitz,
Haber et al.
1972)。Lefkowitz等利用该层析柱成功部分纯化获得了b2肾上腺素的受体蛋白，从而建立了可广泛应用的纯化扩散型配体G蛋白偶联受体的方法。通过该方法纯化b2肾上腺素的受体蛋白纯度提高了约500~800倍（Lefkowitz
and Haber, 1972）。
随着实验室不停的继续摸索，1979年Lefkowitz实验室再度改进了b2肾上腺素能受体蛋白的纯化方法，他们使用拮抗剂alprenolol偶联的琼脂糖作为介质制作亲和层析柱，建立了更加便捷有效的纯化方法，该方法适合大规模纯化受体蛋白(Caron,
Srinivasan et al. 1979)。
几年后，他们把纯化后的可与肾上腺素结合的细胞表面蛋白导入不响应肾上腺素的细胞后，发现细胞的表现与具有肾上腺素受体的细胞一致(Cerione,
Strulovici et al. 1983; Cerione, Strulovici et al.
1983)。这项实验结果使人们真正相信了细胞表面受体的独立存在。
图4：配体-受体-效应器相互作用的三级复合物模型 (改自 Scientific Background on the Nobel
Prize in Chemistry 2012)
2
肾上腺素受体（扩散型配体的GPCR）的基因克隆
能拿到纯化的肾上腺素受体蛋白，就可以通过测序获得部分蛋白的序列信息，为克隆肾上腺素受体的基因打开了大门。虽然1984年视紫质（Rhodopsin）的基因获得了克隆，但没有人将光感受体与可扩散的激素受体相关联起来，而激素受体表达的低丰度为工作带来了很大困难。
从1986年开始，当时在实验室做助理研究的Kobilka加入并领导了这项工作。起始的工作非常困难，用cDNA文库反复进行实验却得不到正确克隆。Kobilka于是大胆提出了使用基因组文库进行克隆。经过了组内热烈的讨论后，Lefkowitz同意了这一“疯狂”的研究方式。
1986年，Lefkowitz实验室首次成功克隆了编码仓鼠b2肾上腺素能受体蛋白（b2-adrenergic receptor,
β2AR）的基因并进行了测序分析(Dixon, Kobilka et al.
1986（注2）)。对编码基因的序列的分析发现，b2AR与牛“光受体”视紫质蛋白（Rhodopsin）的氨基酸序列具有显著的相似性，二者都具有7次跨膜的区域（Dixon
and kobilka et al., 1986，Nathans J and Hogness DS, 1984）。
Lefkowitz和Kobilka很快推断出Rhodopsin和b2AR可能属于同一家族，这一家族可能编码很多重要的激素受体。这一工作旋即被毒蕈硷乙酰胆碱受体（muscarinic
acethylcholine receptor）的克隆所证实（Numa et al., 1986）。
基于这一推论，Lefkowitz实验室的Kobilka等人很快成功克隆了编码人类b2肾上腺素受体蛋白（b2AR）的cDNA，编码人类b1肾上腺素受体、人类血小板α2肾上腺素受体、5-羟色胺（5HTA1A）受体以及第一个孤儿受体（orphan
receptor）等在内的一系列受体的基因(Frielle, Collins et al. 1987; Kobilka, Dixon
et al. 1987; Kobilka, Frielle et al. 1987; Kobilka, Matsui et al.
1987; Fargin, Raymond et al. 1988)。
工作中得到的信息和技术也帮助了嗅觉受体（odorant
receptor）这一超家族的发现和克隆（Linda and Axel,
1991），该项成果荣获2004年诺贝尔生理学或医学奖。
图5：GPCR（7次跨膜受体）介导的信号转导和脱敏机制
G蛋白和Arrestin两种不同的机制参与GPCR的信号转导。激动剂与受体结合，激动偶联于受体上的异源三聚体G蛋白。活化的G蛋白从受体上解离，并进一步激活经典的第
3 GPCR工作机制研究
20世纪60年代Sutherland发现cAMP介导激素引起的细胞响应，于1971年获得诺贝尔奖，1986年Gilman分离纯化得到了G蛋白，并获得了1993年诺贝尔奖，这些都是GPCR信号转导的重要机制。除以上信号机制以外，Lefkowitz实验室和一些其他实验室也对GPCR的工作机制研究中做了重要贡献，包括提出并发展三元复合物模型，阐明受体磷酸化和脱敏机制，以及独立于G蛋白的b
-抑制蛋白（b-arrestin）介导的信号转导系统等。
1）三元复合物模型的提出和发展
应用体外蛙红细胞中的beta2肾上腺素受体模型，Lefkowitz等观察到Gpp(NH)p,
GTP，以及其他嘌呤核酸在不与受体结合的状态下降低受体的亲和力(Lefkowitz, Mullikin et al.
1976)。
在此基础上，D-lean应用同位素标记的配体与受体的结合实验结果而提出“三元化合物”模型（Ternary complex
model）。三元化合物模型包括激素H，受体R，与细胞膜成分X，而鸟苷酸可使三元化合物HRX中细胞膜成分X从受体R上解离出来，导致配体亲和能力的降低(De
Lean, Stadel et al. 1980)。
实验室的Kent进一步通过计算机模拟系统收集Beta-肾上腺素受体与配体结合的信息，发现激动剂与受体之间有高亲和力和低亲和力两种不同的状态，而鸟苷酸可介导两种状态之间的转换，并且鸟苷酸的作用有剂量依赖性(Kent,
De Lean et al. 1980)。
这一模型的提出在药理学工作中有广泛应用，既帮助了GPCR下游效应器的鉴定也帮助了发展高效亲和力的配体。该模型后来被实验室进一步发展为扩展型三级复合物模型；并在利用组成型激活突变体研究GPCR和GPCR的偏向性配体研究中得到广泛应用(Samama,
Cotecchia et al. 1993)。
图6：扩散型配体的GPCR晶体结构解析图A：受体分段示意图（Kobilka, Kobilka et al.,
1988），单独的AR 1-5跨膜区域SR (1-5)或6-7跨膜区域SR (6-7)因缺少AR活性而无法与特异配体结
...
2）受体脱敏，磷酸化和其他后修饰
现代药物学发现受体的脱敏是重要的药理学现象。Lefkowitz实验室Mukherjee于1975年报道了持续激活蛙的肾上腺素受体可导致受体特异性脱敏(Mukherjee,
Caron et al.
1975)。受体脱敏表现在异丙肾上腺素激活腺苷酸环化酶最大效应下降25%，而1/2最大效应浓度并没有改变。
进一步的研究发现了b-肾上腺素受体脱敏的主要特点：1.
只有激动剂可导致受体脱敏的发生，而抑制剂能阻断激动剂与受体结合所致的脱敏；2.
激动剂导致的b2肾上腺素能受体的灭活有时间和浓度依赖性(Mickey, Tate et al. 1975; Mukherjee and
Lefkowitz 1976)。
依据这些实验结论可推断受体脱敏并非由受体与配体亲和力降低所造成，而应该是受体数目和活力的影响。几年后，实验室的Stadel等证实了在脱敏的过程中存在受体结构变化(Stadel,
Nambi et al. 1982)。
Stadel进一步应用[32P]同位素标记的磷酸盐预温育方法，得到磷酸化的b2肾上腺素能受体(Stadel, Nambi et al.
1983)。在体外，重组的纯化的火鸡红细胞肾上腺素受体在ATP和cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）的作用下也可达到磷酸化(Benovic,
Pike et al. 1985)。
这一系列的实验揭示了磷酸化在受体脱敏过程中起到重要的调控作用。同年，Strulovici应用体外磷酸化的b2肾上腺素受体再植入受体缺失细胞，进一步证实受体磷酸化与重构系统中膜受体功能减退之间的直接联系(Strulovici,
Cerione et al. 1984)。
1984年，Benovic从仓鼠肺脏中成功提取b2肾上腺素受体，通过高效液相胰蛋白酶肽色谱分析方法，明确阐明了受体中的两个磷酸化位点，证实PKA参与单个b2肾上腺素受体功能的调节(Benovic,
Pike et al. 1985)。
继而，研究组提出了同源脱敏和异源脱敏的概念：同源脱敏是指脱敏受体对其特异性配体反应减弱，而其他受体的效能不受影响；异源脱敏是指当细胞暴露于一种激动剂时，可使多种受体介导的反应减弱(Strasser
and Lefkowitz 1985)。
在证明磷酸化以及PKA在受体磷酸化和脱敏中的作用后，实验组进一步的工作发现b-肾上腺素受体激酶（bARK）也介导受体的脱敏(Benovic,
Mayor et al.
1986)。1990年Lohse的实验数据表明bARK发挥受体脱敏的作用需要一个辅因子的参与，该辅因子与稍早先发现的视觉的arrestin蛋白高度同源，所以命名为b-arrestin(Lohse,
Benovic et al. 1990)。
1991年，实验室的Lorenz等人克隆出b-肾上腺素受体激酶（bARK），发现b-肾上腺素受体激酶（bARK）和催化反应的视紫红质激酶（RK）在氨基酸序列上有高度同源性(Lorenz,
Inglese et al.
1991)。通过对两者共同结构的归纳研究及一些功能实验，实验室推断并克隆出特异介导GPCR脱敏的一个新的蛋白激酶家族GRK（G
protein coupled receptor kinase）(Arriza, Dawson et al. 1992;
Lefkowitz, Inglese et al. 1992; Pei, Tiberi et al. 1994; Pei,
Kieffer et al. 1995)
图7：AR
Gs复合物结构图A：AR与G蛋白复合物结构。图B：AR-Gs蛋白复合物中G蛋白循环示意图。G蛋白聚合过程与GPCR与效应分子通过膜结合的异源三聚体（亚
...
综上所述，通过对b2肾上腺素能受体脱敏的研究，Lefkowitz研究小组与其他小组一起阐明了磷酸化, PKA,
GRK和b-arrestin（b-抑制蛋白）在受体脱敏中的作用，发现了GRK家族。除磷酸化介导的脱敏外，进入21世纪，实验室也率先发现了受体的其他
