基于电子捕获裂解/电子转运裂解串联质谱

2012-12-02 20:29阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/2083726880

转载:质谱技术已经成为当前蛋白质组学研究中不可或缺的平台，质谱数据的信息质量直接决定了蛋白质鉴定的可靠性和鉴定数量．目前，蛋白质鉴定最主要的方法是利用串联质谱检索蛋白质序列数据库[1]．虽然它可以较好地解决大部分简单或中低复杂程度的蛋白质鉴定问题，但随着人们对复杂的蛋白质翻译后修饰鉴定需求的提高，由碰撞诱导裂解(collision induced dissociation, CID)方式获得的串联质谱在鉴定翻译后修饰问题上遇到了很多技术困难，如由于显著的中性丢失而导致质谱中与氨基酸序列相关的离子信息减少、难以确定修饰位点等．
1998 年发现的电子捕获裂解(electron capture dissociation, ECD)[2]和2004 年发现的电子转运裂解(electron transfer dissociation, ETD)[3]可以很好地解决这个问题．这两项质谱新技术的应用为蛋白质组学的发展带来了新的曙光，基于电子的碎裂技术的时代

已经到来．
本文对ECD和ETD技术分别从基本原理、质谱特点、仪器开发、基础研究进展、数据处理算法与软件开发等方面进行了详细的阐述，并对当前的研究问题和未来的发展趋势进行了综合分析．

基于电子捕获裂解/电子转运裂解串联质谱

Fig. 1 Cleavage sites of the peptide bonds
图1 肽链碎裂点示意图

基于电子捕获裂解/电子转运裂解串联质谱

Fig. 2 Publications of ECD and ETD on PubMed
图2 PubMed 上检索到的ECD和ETD
发表论文数量与年度的关系
白: ECD; 黑: ETD.

基于电子捕获裂解/电子转运裂解串联质谱

基于电子捕获裂解/电子转运裂解串联质谱

Fig. 3 Example of CID and ETD spectra
图3 CID 与ETD 质谱特点的比较
(a) 带2 个电荷肽段LIDDNNLNTAGEGGCYPR的CID质谱. (b) 带2 个电荷肽段LIDDNNLNTAGEGGCYPR 的ETD质谱. (c) 带3 个电荷肽段IGENKDAMDGWFR的CID质谱. (d)带3个电荷肽段IGENKDAMDGWFR的ETD质谱.

基于电子捕获裂解/电子转运裂解串联质谱

Fig. 4 Difference between CID and ETD spectra
图4 CID 和ETD 的碎裂特征比较
(a) CID. (b)ETD.
1 基于电子的碎裂技术简介
在当前的蛋白质鉴定中，CID是最常用的肽段碎裂技术，CID 常应用于采用胰蛋白酶(trypsin)酶切、在质谱仪中离子化的肽段．肽碎裂过程主要产生b 和y类型的离子，如图1 所示[1]．相应地，常用的蛋白质鉴定软件也主要是利用这两种类型的离子峰信息与理论质谱进行匹配，可靠的匹配结果一般依赖于匹配上较多的强度较高的连续谱峰．CID在蛋白质鉴定中已经有很多成功的应用，但随着蛋白质组学研究的逐渐深入，人们对肽段或蛋白质的碎裂提出了更多更高的要求．如对于非胰蛋白酶酶切的较长肽段，或者发生翻译后修饰的肽段，CID的碎裂途径往往受到很大的抑制，导致产生的质谱有用信息相对于未修饰的肽段减少，使得鉴定结果的可靠性显著降低．因此，寻求新的更有效的碎裂方法最近几年已成为蛋白质质谱领域的一个重要研究方向．
1998 年，McLafferty等[2]意外发现了蛋白质电子捕获碎裂的现象，进而应用到蛋白质鉴定领域[2,4]，这标志着蛋白质基于电子的碎裂技术时代的开始．与CID 基于碰撞能量再分配的基本机理完全不同，ECD一般是通过低能量的自由电子与质子化的多电荷蛋白质或肽离子，在相互作用的过程中由于放热而瞬间产生碎裂，它是一个非各态历经(nonergodic)的过程，主要产生由N—Ca键的断裂而形成的c 和z 类型离子(图1)．由于要同时容纳多电荷蛋白质或肽离子与自由电子在离子阱质谱仪中技术上所面临的困难，ECD 从产生开始就主要应用在傅立叶变换质谱仪(fourier transform mass spectrometer, FTMS)上[5]．由于FTMS 仪器价格昂贵、运行维护成本高等因素，ECD 的应用仅局限于拥有FTMS 仪器的少数实验室中，ECD 在蛋白质组学中的应用受到了仪器方面的限制，并没有获得广泛的开展．
针对ECD 在FTMS上应用的局限性，Hunt 等受ECD的启发，于2004 年发现，通过携带一个电子的阴离子(anion)与肽阳离子(cation)相互作用，也可以产生类似ECD 的碎裂行为，他们称之为“电子转运裂解”(electron transfer dissociation, ETD)，进而，他们通过改进已有的线性离子阱(linear ion trap)质谱仪，在原有仪器的后端添加了通过化学离子化的方法引入携带电子的阴离子，然后与肽阳离子在离子阱中相互作用而产生碎裂，发明了一套完整的ETD技术[3]．由于线性离子阱质谱仪具有高灵敏性、快速扫描特点和仪器的性价比较高等优势，它已在蛋白质组学实验室中被广泛采用，因此ETD 技术的发明使得基于电子的碎裂方式在蛋白质组学研究领域中有了更广泛的用武之地，为下一代蛋白质组学的发展带来了新的“曙光”，基于电子的碎裂方式开始在蛋白质组学领域中获得广泛的应用．除了ECD 和ETD 以外，其他基于电子的碎裂技术还有电子分离裂解(electron detachment dissociation)[6]，电子激励裂解(electronic excitation dissociation)[7]等．相对于ECD 和ETD，这些技术当前在蛋白质组学中的应用还很少．
考察一项新技术的影响，还可以通过检索发表的论文．图2 是PubMed 上发表的以ECD 或ETD为研究内容的论文数量随年度的变化关系．查询时间段为：ECD( 1998-01-01～2009-04-15)，ETD(2004-01-01～2009-04-15)．查询内容为论文题目或摘要中含有“electron capture dissociation”或“electron transfer dissociation”．从图2 中可看出，以研究ECD或ETD为内容的论文数量最近几年出现了较快的增长趋势，特别是2009 年，仅三个半月时间，发表ETD 方面的论文数量就已经超过了2008 年全年的总数．
2 ECD/ETD 串联质谱的特点
ECD 或ETD是电子与带多电荷的肽段或蛋白质阳离子进行相互反应的过程中而产生碎裂的，电子在碎裂过程中起到了至关重要的核心作用，它们之间的主要差别是ECD 的电子是自由电子，而ETD 中的电子是通过小分子的阴离子提供的．
ECD 与ETD 的碎裂机理是类似的，目前还基本没有报道它们之间有什么显著的差异，但与CID 的碎裂机理却迥然不同，CID 主要是基于碰撞能量再分配的原理，结合能小的键容易断裂，在时间尺度上比ECD/ETD 要慢，因此通常也称为“慢热”(slow-heating)碎裂．碎裂机理上的不同导致了ECD/ETD 与CID串联质谱的行为特征上存在着很大的差异．
2.1 离子类型的差异
CID主要断裂肽键，产生以b 和y类型为主的离子峰，而ECD/ETD则主要碎裂N—Ca键，产生以c 和z类型为主的离子峰．如图3a 和3b分别为带2 个电荷的肽段LIDDNNLNTAGEGGCYPR 的CID谱和ETD 谱，对于用胰蛋白酶酶切的带2 个电荷肽段的多数ETD谱，由于仅在肽段的C 端出现碱性的赖氨酸K 或精氨酸R，ETD 谱中z 离子要远远多于c离子，但在出现遗漏酶切或者肽段含有组氨酸的情况下，则c 离子的出现会相对增多．
图3c 和3d 分别是带3 个电荷肽段IGENKDAMDGWFR的CID谱和ETD谱，带3个电荷的肽段中除C 端的氨基酸外，一般还会含有另外的碱性氨基酸，c 离子的出现机会增多．另外，还有少量的a和y类型的离子．
2.2 与氨基酸序列依赖关系的差异
CID在某些氨基酸组成的断裂点上常表现出断裂的倾向性，如脯氨酸P 的N 端断裂容易产生强度较高的谱峰，如图4a 中的b5-y7，b7-y5，b10-y2均对应于P的N端断裂．而ECD/ETD由于断裂的是N—Ca键，P的侧链环状结构导致P 的N端断裂碎片基本没有观测到，而P 的C 端断裂则有碎片产生，如图4b 所示，z2，z5，z7均未出现，而z4，z6则比较明显．由于离子阱质谱仪的“三分之一”效应，通常z1观测不到．
2.3 侧链丢失的差异
在CID 谱中，经常观测到碎片离子失水或失氨的情况，而在ECD/ETD 中则不典型，很少出现，但ECD/ETD 的母离子携带电子后导致电荷减少，经常出现完整肽段的侧链丢失情况，如图3b,d和图4b 中的右侧未标注系列高峰簇就对应于母离子(带电子)的侧链小分子丢失系列峰．此外，在ECD中，随着电子能量的增加，由侧链断裂而生成的离子，如w离子出现的机会增多．
2.4 翻译后修饰的差异
对于常见的磷酸化、糖基化等翻译后修饰，CID谱中发生修饰基团的中性丢失比较常见，如磷酸化80 u或98 u对应磷酸基团的丢失，而ECD/ETD 则可以保留完整的修饰基团，在碎片离子上携带修饰基团为翻译后修饰位点的鉴定提供了重要信息．因此，最近几年，ECD/ETD在翻译后修饰鉴定的应用研究上开始越来越广泛．
上述总结的CID 与ECD/ETD 的四点主要差异也反映出他们之间的互补特性，将二者各自的优势相互结合起来，可以在蛋白质鉴定中提供更加丰富的肽段和蛋白质信息．这种互补特性主要表现在如下四个方面：
a．CID 适合于氨基酸序列长度较短的、带2个或3个电荷为主的肽段碎裂，而ECD和ETD 更适合于氨基酸序列长度较长的、带3 个或3 个以上电荷为主的肽段碎裂．二者的有机结合可以显著提高蛋白质鉴定的序列覆盖度[8]．
b．CID 对于氨基酸序列的依赖性较强，而ECD/ETD 对于氨基酸的序列依赖相对较弱(除了一般观测不到由氨基酸P 的N 端断裂而形成的谱峰)，能够产生更多的连续离子系列峰．
c．根据CID 对于常见的磷酸化和糖基化等容易形成中性丢失，而ECD/ETD可以保留完整的修饰基团的特点，可以先利用CID判定修饰的存在，然后利用ECD/ETD鉴定修饰的位点．
d．CID 适合使用胰蛋白酶酶切的肽段，这样的肽段一般仅在两端带有碱性基因(N 端的自由氨基和C 端赖氨酸或精氨酸的碱性侧链基因)；而ECD/ETD 更适合用Lys-C 等产生碱性氨基酸较多的酶来酶切蛋白质，生成的肽段碎裂质量较高．
鉴于ECD/ETD 的上述特点，开发带有ECD或ETD 功能的质谱仪器已经成为各质谱仪厂商角逐的“战场”．

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