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二硝基水杨酸法测定还原糖

2014-10-31 18:04阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/2083726880

做淀粉酶实验，需要测定酶活，看淀粉酶解产物-二糖的含量，少不了用DNS显色法。
DNS即3，5-二硝基水杨酸法，是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，DNS中含有的硝基使其有较强的氧化性, 与醛基在加热的条件下发生氧化还原反应, 生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在
多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中。
而还原糖本身则被氧化成糖酸及其它产物。
3，5-二硝基水杨酸是一种氧化剂，能与还原糖作用，使硝基还原成氨基，溶液变为橙色。在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比.
二硝基水杨酸试剂
称取酒石酸钾钠91 g，溶于500 ml水中，再依次加入3，5-二硝基水杨酸3．5 g，NaOH 2O g，加热搅拌、溶解，再加入重蒸酚2.5 g，无水亚硫酸钠2.5 g，加热搅拌、溶解，冷却后定容至 1000 ml。储棕色瓶中，放置一周后使用。 分别取葡萄糖（单糖）或者麦芽糖（这是二糖）标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于15 ml试管中，用蒸馏水补足至1.0ml, 分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15 ml刻度。
如果用5 ml刻度，则浓度是否提高三倍？是的！
在540 nm波长下测定吸光度。也有520 nm测定的介绍。有文献报道，木糖与葡萄糖与DNS试剂反应，最大吸收峰出现在490 nm，460nm和480nm二处的吸光度数值也都超出仪器可检出的上限。但在520 nm处，标准曲线在8-40 mg/L，也就是40 ug/ml时，R值最接近1。标准曲线用浓度为1mg/ml 的葡萄糖标准液配制，往往最小浓度设定在200 ug/ml。
EC3.2.1.1 α-淀粉酶；EC3.2.1.2 β-淀粉酶；EC3.2.1.3 糖化酶；EC3.2.1.10 低聚α-1,6-葡萄糖苷酶；EC3.2.1.20 麦芽糖酶。


凡是酶的测定方法都分为两种，一种是底物的减少，另一种是产物的增加。
具体到α-淀粉酶，首先说一下测定底物的减少方法。
测定α-淀粉酶活力所用的底物很多，包括种类繁多的人工底物，那些东西我没做过就不说了。自然底物主要是生淀粉，比如生木薯粉玉米粉大麦小麦等等，实验室所用的可溶性淀粉就是用这些生淀粉做出来的，结构已经有了改变，即使没有淀粉结合域也能降解。
测定淀粉的减少用碘法，原理为淀粉长链中每六个葡萄糖残基构成一个螺旋，可以络合一个碘原子，长链淀粉络合物呈蓝色（颜色深时近黑色），随着淀粉链长度减少，络合物颜色产生变化，减少到少于6个葡萄糖残基后不络合不呈色，可以通过测定吸光度的变化来检测淀粉的减少。测定用波长，我做过试验，600-630nm都稳定，当然，附近波长也可以。通过这个方法来测定的已有成熟流程，称为YOO改良法，不过所用碘浓度较低，我加大到10倍了。值得注意的是，这种方法测出来的酶活力可能有两种定义方法，一种是淀粉减少的量为克的倍数，另一种为OD值变化，个人推荐前一种。
测定产物的增加就麻烦了，作用产物为糊精和麦芽寡糖，葡萄糖，但所幸它们都有还原端，可以通过测定还原端的数量来检测产物释放量，这就是DNS法。值得注意的是，还原端的数目并不是与DNS呈色反应成线性关系的，分子量不同，还原性大小稍有差别。
另外，酶的来源不同，也对底物特异性有影响。所以，两种都不是绝对准的。
 Q：β-淀粉酶水解产物是β-麦芽糖，用DNS法测定是否准确度够高。
A：只要用麦芽糖来做标准曲线，测定产物释放量就行，用DNS法也可以。
Q：还有如果你的底物（如淀粉）中含有游离的还原糖怎么办？还能用这样的方法来测吗？
A：换淀粉吧，要不就测定底物减少量。
质量好的淀粉产品里，不会含有太短链的麦芽寡糖的，更不会有葡萄糖，我用葡萄糖氧化酶试剂盒测过国药生产的可溶性淀粉，发现有一点点吸光值，可以忽略。所以如果用的淀粉不好，有了麦芽寡糖和葡萄糖，就不能准确测定产物的增加，因为本底要扣除。如果要扣除的本底和酶降解释放的产物量相差不大，就容易引入误差了。所以还是测定底物减少量的好。底物减少量可以用淀粉做一条标准曲线，横轴是淀粉量，纵轴是吸光度，R值可以达到三个九甚至四个。依据吸光度变化可以求出淀粉量的变化。
还是换淀粉产品稳妥点。值得注意的是，可溶性淀粉也是有还原性的，浓度太高时用DNS测定也是有一定吸光度的，只不过比较小。


问：
1 DNS中重蒸苯酚，氢氧化钠，酒石酸钾钠，和无水亚硫酸钠的作用各是什么？
2 还原糖的含量和吸光值在一定范围内成线性关系，这个范围是多少？
3 葡萄糖标准曲线 是否一定过原点？excel计算标准曲线的方程时要包括（0，0）点吗？
4 DNS的配方有好几个版本，这些不同的配方对最后的结果有影响吗？
5 测定加的DNS的量不同，对最后的结果有影响吗？
答：
1、葡萄糖之类的还原糖在碱性条件下，将3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系。
2、苯酚作用：增加色泽强度，使显色液重现性、稳定性更好。
亚硫酸钠：和苯酚差不多，但是用量太多太少均不利于显色。
氢氧化钠：加快反应速度，增强色泽，但是会引起糖损失。
酒石酸钾钠：消除溶解氧，对色泽强度影响不大，但是可以提高其稳定性。
3、线性范围需要自己实验确定，这个不同的人不一样。
4、不一定过原点，这是碱对糖的降解作用导致。
5、肯定有的，你找一个你觉得好的，用加样回收实验验证一下。测不同的糖应该有所区别。
6、加的DNS量是过量的，必须要保证能与所有还原糖完全反应，就ok！


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