在菌种和颜色反应前面相信谁
2017-05-26 19:53阅读：
大肠杆菌的伏-普反应，我们得到的结果是红色，也就是说，大肠杆菌能产生乙酰甲基甲醇或者2，3—丁烯二醇，这是否依赖内源的丙酮酸羧化酶，结论是“不依赖”。
某些细菌能发生如下转换：葡萄糖→丙酮酸（脱羧）→乙酰甲基甲醇（Acetymethyl
carbinol）→2，3—丁烯二醇（2,3—bytaylene
cylycol），在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用产生粉红色的化合物。本试验目的在于测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。2分子丙酮酸脱羧形成乙酰乳酸，继续脱羧形成乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下与胍类、肌酸类物质反应，形成红色化合物，为V-P反应阳性。
大肠埃希菌与产气肠杆菌均能分解葡萄糖，产酸产气，为区分两菌可采用V-P试验及甲基红试验。
大肠杆菌VP反应理应是阴性。
我们做的产气肠杆菌VP反应是阳性。
网络上有人认为大肠杆菌的伏-普反应结果是红色，原因是培养时间过长，或者认为是大肠杆菌菌种不纯。
因为大肠杆菌没有内源的丙酮酸羧化酶。
我们看2013年生物工程学报的一篇论文：
大肠杆菌BA002是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因(ldhA)和
丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因(pflB)的工程菌。厌氧条件下NADH不能及时再生为NAD+,引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡,最终导致厌氧条件下
菌株不能利用葡萄糖生长代谢。pncB是烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)的编码基因,通过过量表达pncB基因能够提高NAD(H)总量与维持合
适的NADH/ NAD+,从而恢复了厌氧条件下重组菌E.coliBA014
(BA002/pTrc99a-pncB)的生长和产丁二酸的性能。然而,BA014在厌氧发酵过程中有大量丙酮酸积累,为进一步提高菌株的丁二酸生产能
力,减少副产物丙酮酸的生成,共表达NAPRTase和来自于乳酸乳球菌 NZ9000中丙酮酸羧化酶
(PYC)的编码基因pyc,构建了重组菌E.coli
BA016(BA002/pTrc99a-pncB-pyc)。3 L发酵罐结果表明,BA016发酵112 h后,共消耗了35.00
g/L的葡萄糖。发酵结束时,菌体OD600为4.64,产生了25.09
g/L丁二酸。通过共表达pncB和pyc基因,使BA016的丙酮酸积累进一步降低,丁二酸产量进一步提高。
2009年生物工程学报的一篇论文讲的是
乳糖诱导丙酮酸羧化酶基因在大肠杆菌中的表达及对丁二酸产量的影响。大肠杆菌DC1515是敲除葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)、乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflA)基因的菌株,具有发酵生产丁二酸的潜力。为进一步提高菌株DC1515的丁二酸生产能力,将枯草芽孢杆菌丙酮酸羧化酶
(PYC)基因转入其中。用乳糖代替IPTG诱导pyc表达,确定了最佳乳糖加入时间、乳糖浓度及诱导温度。在此基础上,考察了补加乳糖对丁二酸产量的影响。结果表明:由于ptsG基因缺失,当培养基中葡萄糖浓度达到15g/L时,乳糖诱导作用并不受葡萄糖抑制。优化诱导条件后,pyc过表达菌株的丁二酸产量达15.17g/L,为对照菌株的1.78倍。间歇补加乳糖2次至浓度为1g/L,丁二酸产量可进一步增至17.54g/L。研究结果为以葡萄糖为底物生产丁二酸的过程中乳糖诱导外源基因在大肠杆菌中的表达奠定了基础。乳糖诱导降低了成本,有利于实现丁二酸发酵生产的工业化。
这一下，我们知道大肠杆菌缺乏内源性丙酮酸羧化酶。大肠杆菌有“磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶”。
枯草芽孢杆菌的伏-普反应，得到的结果是红色，这也是对的。
试验项目 大肠杆菌
产气肠杆菌 变形杆菌 枯草芽孢杆菌
V-P反应
红色 红色
红色 淡红色
甲基红试验
黄色 黄色
黄色
红色
另一方面，该是阳性的又会出现阴性结果。例如网络上另外一个资料说，从V.-P.实验结果中可以看出，大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌都呈阴性，但理论上产气肠杆菌为阳性反应，这可能是实验操作问题，所以原因还待进一步探究。这个结论与前述大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌的表现不一。
不仅如此，继续往下看：甲基红试验：从实验结果中可以看出，大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌都呈阳性，理论结果产气肠杆菌应该为阴性，这可能是实验操作问题。
这么看，这个实验用的产气肠杆菌出了问题。
大肠杆菌和产气肠杆菌都属于肠道微生物，所有肠道微生物都能够利用葡萄糖作为其能量来源，但是它们的代谢途径不同，因而所产生的终产物不相同。大肠杆菌利用葡萄糖发酵，主要产生混合有机酸，比如乳酸，乙酸和甲酸等，使培养基pH下降（至4左右），产气肠杆菌利用葡萄糖进行发酵，主要产生乙醇，3-羟基丁醇和少量有机酸，培养基pH下降不很明显（6.5左右）。甲基红的变色范围为pH4.2（红）~6.3（黄）。大肠杆菌分解葡萄糖产生有机酸，培养液由原来的橘红色变成红色，因此MR反应为阳性。同理，产气肠杆菌MR反应为阴性。
V-P实验用于证明在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸通过缩合和脱羧生成3-羟基丁酮，之后被还原成2,3-丁二醇。3-羟基丁酮在碱性条件下，可被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与培养基里蛋白胨中的胍基作用，生成红色化合物。
于是，我们在菌种和颜色反应面前，我们相信“颜色”！代谢特性不会造假！
糖发酵试验原理，从实验结果中能够看出，三种细菌（大肠杆菌、变形杆菌、产气肠杆菌）在葡萄糖中发酵都能产酸，只有大肠杆菌能产气(理论上还应该包含产气肠杆菌)；在乳糖中，三种菌能够产酸，只有大肠杆菌能产气；在蔗糖中，只有变形杆菌能够产酸产气。
这个意思是，大肠杆菌、产气肠杆菌在蔗糖发酵液里，“不能产酸产气”！我没有安排蔗糖实验，，我们有大肠杆菌、产气肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌。
大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
