小鼠基因型鉴定
2014-07-25 20:02阅读：
小鼠基因型鉴定
本次实验用脚趾鉴定
鉴定前准备：剪脚趾，放入到EP管中，并且标号。（小鼠脚趾标号顺序：腹部朝上，从右下肢最靠外的脚趾开始为1号，连续数，左边的靠内侧的为第六个脚趾，前肢也是从右肢开始，若下肢都剪了第一个脚趾，上肢剪了第二个，则小鼠编号为21，其它依此类推）
⑴把送过来的装有脚趾的EP管重新编号
⑵每个EP管中加入198μL
tail buffer+2μL
pk(蛋白酶k)，55℃过夜（约十个小时，也可以升高温度
缩短时间）
⑶
SPAN>第二天取出EP管，用涡旋器振荡，使DNA充分释放
⑷14000转
离心3分钟
⑸取出新的EP管，编号，每管加入200μL异丙醇
⑹将上清液转入到装有异丙醇的EP管中，用涡旋器振荡，使混合均匀（可见白色丝状沉淀为DNA）
⑺14000转
离心3分钟（将管一个方向放置，使DNA沉淀于管中的同一个位置）
⑻用隔膜真空泵把液体吸出去，只剩下DNA(也可以把液体倒出，口朝下扣到纸上，晾干)
⑼每个EP管加入30-50μL的DEPC水或ddH2O振荡，混合均匀，放入到65℃烘干箱中，20-30分钟，帮助DNA溶解
⑽配制10μL(或20μL)的PCR体系，primer:0.5μL(有两对，其中一对为内参引物，所以要加4种引物，每种加入0.5μL)；gene：1μL;mix:5μL(为2x的PCR
mix 用时要稀释为1x的，所以若是20μL的体系则所用mix为10μL)；其余的用ddH2O补齐即可，如10μL的体系要补的双蒸水为2μL（规则：一般先加量多的，后加量少的，先水后其它）
⑾不同的基因用不同的PCR程序进行体外扩增，扩增好的4℃保存
⑿配凝胶：鉴定HBV DNA分子的凝胶中琼脂糖的百分含量为1.2%(TCR
δ
DNA分子的凝胶中琼脂糖的百分含量为1.5%。按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量)即称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL
1x TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀；胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于一水平制胶器中，并放好样品梳子。待胶液冷到60℃左右时，放入25μL的EB染料，轻轻混匀，将混匀的胶液缓缓倒入到有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。待胶液凝固后，轻轻去出梳子，将有机玻璃内槽取出放入电泳槽内，黑色一端对应黑色一端。放入电泳缓冲液至电泳槽中使缓冲液刚好没过胶平面
⒀加样和电泳：因mix中含有电泳指示剂，可直接上样，不用加上样缓冲液，每个加样孔加10μL的扩增好的DNA样品。注意第一个孔要加入Marker(本实验室为Trans 2k
plus
II)（还要有阳性、阴性和wild
type对照；HBV阳性的有2条带，wild type 1条带；而TCR
δ的2条带的为杂合子，对应的上方1条带的为纯合子，下方1条带的为wild type）
⒁观察：用凝胶成像仪观察（或紫外灯下观察），确定基因型。
