下里巴人的低频基因突变检测方法探索

下里巴人的低频基因突变的检测方法探索 2013-07-04 17:03 最近，我们实验室的孙海燕同学在进行低频基因突变检测方面取得了一些进展，令人振奋，我就此写几句相关内容吧。
一说起基因突变检测的方法，首先想到DNA测序这个方法，长期以来一直被奉为金标准！其次有各种基因分型的检测方法，各有优缺点吧；
长期以来，低频基因突变一直是个难题，这方面的检测具有重要的生物学意义和应用价值，例如针对肿瘤患者外周血基因突变检测以及孕妇外周血中胎儿基因突变检测就离不开低频基因突变检测技术，这里不再赘述了。 DNA测序的准确性不要质疑，但是敏感性较差，15%以下的突变不容易检测出来，一般将下限定在10%，短片段的焦磷酸测序反应灵敏度可以提高到2-5%，但是方法繁琐，价格昂贵，需要贵重仪器。D-HPLC有点类似，灵敏度也就达到2-5%，但是不能确定具体突变； 高分辨溶解曲线（HRM）技术可以利用突变型与野生型及其杂合子结合饱和荧光染料解链温度的差异从而可以检测5%的基因突变，结合非标记探针灵敏度可以达到1%； 以等位基因特异扩增为核心的ARMs 技术能够特异性的优势扩增突变基因，从而提高基因突变的检测灵敏度，目前的试剂盒最高可以达到1%。最近一段时间，二代测序（深度测序）热火朝天，通过高通量的测序可以发现低频突变，由于二代测序本身的精度只有99%，因而灵敏度我暂定为1%，当然通过万次的测序或许可以将某个位点的低频突变提高到1%； 数字PCR 也是一个新生事物，可以检测到低频突变，千分之一甚至万分之一理论上是可以的，但是，只能针对已有的变异类型，不能确定具体突变啊，也依赖先进的数字PCR仪器，目前刚刚进入市场，其便捷和可靠性还需要进一步观察！
我们在高分辨溶解曲线（HRM）技术的基础上，利用弹回探针和突变型DNA扩增富集技术，以EGFR和K-RAS基因突变为靶标，经过多次的探索，在外周血中能够检测1%-0.01%的基因突变，该技术已经能够完全满足利用外周血检测肿瘤组织的E