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关于细胞污染的一些总结(未完)

2015-06-25 18:32阅读:
细胞污染一般有细菌污染、支原体污染、黑胶虫污染、真菌污染、原虫污染、病毒污染以及非细胞污染。
细菌污染
细菌是一种原核细胞微生物,其大小以微米(μm)计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等,革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见
细菌污染之后多数情况下培养液短期内颜色变黄,表明有大量酸性物质产生,出现明显混浊现象;有时静置的培养液液体初看不混浊,但稍加振荡,就有很多混浊物漂起(可能是细菌数目太多沉淀了)。细菌污染之后对细胞生长明显。而且细菌生长一般比较迅速,比真菌快,一般一天培养基就会浑浊变污染
在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类,或者涂板过夜培养观察;有的培养液改变不明显而又疑有污染,可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min,沉淀中加入无抗生素的培养液2ml,置于37℃培养,24h可得结果。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。
关于细胞污染的一些总结(未完)
细菌污染
真菌污染
真菌污染是细胞培养过程中也很常见,尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不浑浊倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝,并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠;念珠菌或酵母菌形态呈卵形,散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

细胞和真菌污染多在出传代、换液、加样等开放性操作之后发生,细菌一般24h以后,真菌24h小时就很明显。污染初期可采取一定的补救措施。但是如果细胞价值不大或冻存细胞多,最后立即丢弃,以免污染其他细胞及操作间。尤其是真菌污染,因为孢子比较难清除。再次培养细胞之前一定要彻底打扫细胞操作间及二氧化碳培养箱。若污染细胞价值较大又难重新获取,可采用5~10倍于常用量的抗生素冲击,加入高浓度抗生素后作用24~48h,再换入新鲜培养液,有时可能奏效。细菌一般用青霉素,链霉素等,真菌用两性霉素B、红霉素、制霉菌素和链霉素等。
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支原体
支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物,最小直径0.2μm,一般过滤除菌无法去除它,光镜下难以看清它的形态结构。支原体无细胞壁形态呈高度多形性。可为圆形、丝状或梨形。支原体感染初期不易发现,多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6—8.0),对酸耐受性差。对热比较敏感,对一般抗生素不敏感。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。支原体用普通染色法不易着色,用姬姆萨染色很浅,革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长,营养要求比细菌高。
培养细胞受支原体污染后,部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢或完全终止,引起细胞病变、贴壁细胞脱落、裂解等。但多数细胞污染后无明显变化,或略有变化,若不及时处理,还会产生交叉污染。
细胞污染支原体的检测方法有:培养法、染色法(有Giemsa或地衣红染色和DNA荧光染色法两种)、3H-胸苷掺入法、电镜观察法、生物化学方法、免疫法、聚丙烯酰胺电泳法、探针杂交法和PCR方法检测。
营养要求比一般细菌高,除基础营养物质外还需加入1020%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。最适pH7.88.0之间,低于7.0则死亡,大多数兼性厌氧,有些菌株在初分离时加入5%CO2生长更好。生长缓慢,在琼脂含量较少的固体培养基上孵育23天出现典型的荷包蛋样菌落:圆形(直径0.1-1.0mm),核心部分较厚,向下长入培养基,周边为一层薄的透明颗粒区。此外,支原体还能在鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长。支原体污染细胞后,特别是重要的细胞株,有必要清除支原体,常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。
支原体最突出的结构特征是没有细胞壁,一般来讲,对作用于细胞壁生物合成的抗生素,如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感;对多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮;其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用,所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体,不影响细胞本身的代谢,并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞,不会重新感染支原体。
细胞刚开始被支原体污染,细胞生长极为缓慢,而且状态不好,细胞之间及底部总有一些亮晶晶的颗粒状物质,换液后好些,但过2天又会增多,培养液清亮,严重时象一层细沙铺在瓶底。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染(一些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。培养细胞支原体污染虽然不对细胞产生急性毒性作用,但可使细胞性状发生改变而影响细胞脂质体的转染和病毒对靶细胞的感染。包装细胞与靶细胞支原体污染的有效清除能明显改善病毒包装时的转染效率及靶细胞感染效率。
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