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检测细胞存活与增殖?MTT还是MTS?

2016-11-03 14:49阅读:
​在往期小诺有分享了一些细胞培养相关的文章,今天,我们来看看细胞检测方面会用到的技术——MTT和MTS

技术原理 ◀

MTT法原理为活的哺乳动物细胞线粒体脱氢酶(mitochondrialde omgenase)能够裂解MTT(四甲基偶氮哇盐3-(4,5-dimethylazol-2-yl)-2,5-dipheny- tetrazoliumbromide)的四氮哇环,使黄色的MTT还原变为紫色的衍生物(MTT-formazan),该物质溶解后在560-610nm中有一个较宽的最大吸收峰,通过酶标仪测定MTT-formazan吸光度(A),该值的大小与活细胞数之间有良好的线性关系。
但由于常规的MTT法最终产生的MTT-formazan不溶于培养基,故在检测之前必须除去大量的培养基上清,然后加入有机溶剂酸化异丙醇或DMSO等溶解MTT-formazan颗粒,这样给操作带来的不便,使实验的重复性较差。因此,是否能形成一种水溶性的甲瞪产物是使该法更为有效的关键。
为此,Oween等设计出了一种新型的MTT类似物一MTS,MTS法原理同MTT法,但优于MTT法。MTS在PMs(Phenazinemethosulfate)的存在下可被活细胞还原形成水溶性的甲增产物(故MTS需与PMS合用),因而被用来建立了可检测细胞活力和增殖能力的MTS检测法。 MTS形成的水溶性甲腊产物在490~500nm处有最佳吸收,我们一般选择492nm。每孔检测的细胞数量在3000~5000为宜,作用一小时后即可检测,以3小时的检测结果为最佳。

▶ 与MTT法相比,MTS有以下优点

1 操作简便
,MTS中生成的甲脂极具水溶性,省去了MTT法需离心除去上清液和加入有机溶剂这一步骤,可一次检测大量样品。
2 MTS易于配制和储存,在PH>6.5的缓冲溶液中易溶解配成溶液,且可在4 ℃下保存一段时间。
3 快速,加入药后一小时即可检测结果(2-3小时为最佳),而MTT法的作用4个小时。
4 敏感,比MTT法测定统一样品敏感性高。
5 特异性强,MTT法形成的甲增产物为桔黄色,培养体系中一些黄色代谢产物和试剂均可影响检测结果,而MTS/PMS法形成的甲增产物为深棕色检测时外部因素影响较小,所以特异性较强。
6 重复性良好。

▶ MTS protocol ◀

MTS法检测药物半抑制率
1) 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度3000~5000/孔。
2)5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上, 细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药。一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔。建议设5个,否则难以反应真实情况
3)5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
4)每孔加入100ulMTS溶液,即MTS母液,与培养基比例为1:9,继续培养1-3h。在酶标仪OD492nm处测量各孔的吸光值。
5)记录各孔吸光值,使用GraphPad prism软件计算药物半抑制率。
MTS法检测细胞增殖
1)收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度3000~5000/孔,5%CO2,37℃孵育。
2)24小时后吸去培养基,每孔加入100ulMTS溶液,即MTS母液与培养基比例为1:9,继续培养1-3h。在酶标仪OD492nm处测量各孔的吸光值。
3)连续检测3天,每天3复孔,在酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
4)记录3天的各孔吸光值,使用GraphPad prism软件计算细胞增殖曲线。

▶ MTS 注意事项 ◀

1、MTS需避光,所以操作时应注意避光。
2、培养过程中换液,如果培养时间较长,应适当更换细胞培养液,补充营养物质。
3、防止边缘效应,96孔板边缘应该滴加PBS,边缘孔的水分挥发较快,药物易被浓缩,对实验影响大。边缘孔加入PBS 溶液后能够在一定程度上保持实验组的水分。


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