在 真核细胞内，小的非编码RNA通过靶向mRNA来阻止蛋白质的翻译进程，从而沉默基因表达。这些miRNA可以招募一种叫做RNA诱导性沉默复合物 （RISC）的核糖核蛋白复合物，并引导其靶向mRNA，造成miRNA-mRNA退火，从而令RISC发挥翻译抑制作用（图：二元及三元复合物，A）。 Argonaute（Ago）蛋白是RISC的关键组成部分，它在原核细胞和真核细胞中都是高度保守的，并在基因沉默中发挥着不可缺少的作用。人们对 Ago蛋白沉默基因机制的了解，最初始于对原核细胞内由Ago蛋白参与形成的二元复合物和三元复合物的X射线晶体学的研究。在原核
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在 真核细胞内，小的非编码RNA通过靶向mRNA来阻止蛋白质的翻译进程，从而沉默基因表达。这些miRNA可以招募一种叫做RNA诱导性沉默复合物 （RISC）的核糖核蛋白复合物，并引导其靶向mRNA，造成miRNA-mRNA退火，从而令RISC发挥翻译抑制作用（图：二元及三元复合物，A）。 Argonaute（Ago）蛋白是RISC的关键组成部分，它在原核细胞和真核细胞中都是高度保守的，并在基因沉默中发挥着不可缺少的作用。人们对 Ago蛋白沉默基因机制的了解，最初始于对原核细胞内由Ago蛋白参与形成的二元复合物和三元复合物的X射线晶体学的研究。在原核
细胞内，Ago蛋白与引
导链（DNA）结合在一起，形成二元复合物；如果这个二元复合物再与靶标链（RNA或DNA）结合在一起，则形成三元复合物。这些分子结构学的研究主要集
中在siRNA介导的靶标mRNA的剪切，而最近对于真核细胞内同类复合物的研究则集中于miRNA介导的翻译抑制作用。本文则主要介绍Schirle等
人在由人类Argonaute2（hAgo2）参与形成的二元复合物和三元复合物结构方面的研究。
Ago蛋白采取双叶支架的折叠形式，由 N端（N和PAZ结构域）及C端（MID和PIWI结构域）两叶组成。PIWI结构域为RNaseH折叠，它包括参与siRNA介导的靶标剪切的催化性酸 性残基。对嗜热栖热菌（Thermusthermophilus）Ago（TtAgo）二元复合物与引导链（此处指DNA）结合的结构学研究则发现了位于 两叶之间的核酸结合通道，其中，引导链已磷酸化的5’端位于Ago的MID结构域内，3’端则位于PAZ结构域。值得注意的是，引导链上2至6位的核苷酸 呈现出螺旋状排布，其碱基指向螺旋外侧，以便与靶标RNA配对。因此，这一螺旋结构组成了靶标识别的成核步骤。
后续的结构学研究则对 TtAgo与DNA引导链及靶标RNA（或DNA）结合在一起所组成的三元复合物进行了研究。这些研究明确了与催化循环中成核、扩展、剪切步骤相关的枢纽 样构象改变。在这些结构学研究中，研究人员使用不同长度的，与引导链种子片段（第2至8位核苷酸）、靶标剪切位点（第10和11位核苷酸）、以及增补片段 （第12至19位核苷酸）互补的靶标链。研究还确定了一对Mg2+及位于Ago蛋白PIWI结构域内的酸性残基在介导化学物质剪切方面的作用。从功能学的 角度看，DNA和RNA引导的原核细胞内的Ago都会参与防御可移动遗传元件（mobil egenetic elements）的过程。
siRNA 介导的靶标mRNA剪切需要引导链和靶标链精确互补配对，但与此不同，miRNA只需要引导链和靶标链在配对时横跨靶标mRNA的种子片段（核苷酸2至8 位），从而抑制翻译、导致降解。Dicer和Ago这两种酶类物质参与介导miRNA的生成，并将前体miRNA转化成为成熟的miRNA，随后成熟 miRNA被装载于Ago上。为了搞清楚miRNA介导的翻译抑制原理，研究者将针对原核生物Ago（pAgo）复合体的结构学研究，扩展到了真核细胞内 Ago（eAgo）的领域。这包括对hAgo2的二元复合物的研究以及与引导RNA链结合的芽殖酵母Kluyveromycespolysporus Ago（KpAgo）的研究。引导RNA链的种子片段——混合序列或者确定的序列——结合于eAgo复合物的两端，2号至5号核苷酸指向外侧，可与靶标 RNA配对，这一点与原核细胞内情况一致。此外，对与引导RNA结合的KpAgo二元复合物的研究发现了一个关键的谷氨酸，它与剪切元件的构象的形成相 关。这个氨基酸插入eAgo的“催化袋”内，从而形成完整的催化四合物（含有四个酸性残基）。
若要将这些研究扩展到三元复合物上，需要 Schirle等人获得并纯化得到毫克级的、结合于引导RNA某个确定序列的hAgo2，这样才能有足够的物质以制备、结晶三元复合物以及进行结构测定。 结构分析借助两个复合物的两组X射线数据（分辨率均为2.9Å）来完成，这两组数据分别为携带5’端磷酸化的引导RNA（长度为21个核苷酸）的 hAgo2二元复合物的X射线数据（图：二元及三元复合物，B），以及额外携带靶标RNA（长度为11个核苷酸）的三元复合物的X射线数据。在这个三元复 合物中，靶标RNA与引导RNA（分辨率为1.8to2.5Å）的2至7、2至8或2至9号核苷酸片段互补（图：二元及三元复合物，C）。
Schirle 等人的研究结果表明，有hAgo2参与的三元复合物形成的过程中，引导链-靶标链双链结构中的小沟形状互补，促进了复合体的形成，互补段跨越种子片段2至 7位核苷酸，此外，相互作用的Ago折叠中的疏水性残基也有助于该复合体的形成。这解释了为何种子片段区域的引导链-靶标链的错配会导致严重后果。与之相 反，如果错配发生在8和9位核苷酸，则无伤大雅。早期针对二元eAgo复合体的结构学研究，发现了在引导链第6和7号核苷酸之间存在一个扭结，这是源于来 自蛋白质螺旋α7的异亮氨酸残基的插入。令人吃惊的是，Schirle等人发现，一旦三元复合物形成，6和7号核苷酸就会形成堆叠螺旋的构象，α7结构则 有一个4Å的移动。这一改动才能使得引导链-靶标链双链结构得以存在于hAgo2折叠内。
hAgo2 双元复合物与确定序列引导RNA相结合的另一个引人注意的发现是，跨越14至18号核苷酸的引导链首次被检测到，此外，与预想一致，该复合体与引导链的两 端都结合，以及种子片段采取螺旋排列形式。14至18号核苷酸这一段序列，结合在N和PAZ结构域之间的一个狭窄通道内，由于其碱基指向内侧，因此无法进 行碱基配对。与之相对，一旦和靶标RNA一起形成三元复合物时，14至18位核苷酸片段就会出现巨大的构象改变，从原本的松散状转变为堆叠在一起，其碱基 指向外侧，以便进行碱基配对。
当hAgo2二元复合物变为三元复合物时，在引导链内所出现的显著的构象改变，促使Schirle等人对 miRNA靶标机制提出了一个逐步进行的模型，miRNA引导链首先对mRNA进行判断，通过种子2至5位核苷酸配对，鉴别出候选靶标位点。这一步触发了 hAgo2构象的改变，包括α7和PAZ结构域，种子片段6至8位核苷酸，以及增补片段13至16位核苷酸组成的螺旋结构中，碱基指向外侧，以便进行额外 的靶标识别。在这个模型中，9至12位核苷酸不参与碱基配对，说明这一片段内的退火对翻译抑制不起重要作用。因此，Ago2蛋白中跨越2至8号及13至 16号核苷酸的引导链-靶标链识别，避免了与核苷酸-结合通道内完全配对相关的拓扑学约束。
今后的工作中，将对更长的靶标RNA进行研 究，从而进一步观察在miRNA介导的hAgo2三元复合体内的引导链-靶标链配对情况，不仅仅局限于2至8位核苷酸，还包括13至16位核苷酸的片段。 此外，siRNA介导的剪切过程，需要靶标mRNA与hAgo2（hAgo1、hAgo3及hAgo4则不需要）精确配对的原因还未知。这样的剪切由 PIWI结构域内的RNaseH折叠参与，需要引导链和靶标链10和11号位的核苷酸的碱基配对，以及一对Mg2+和催化性四合体——由组氨酸及三个酸性 残基组成——在hAgo2剪切位点的精确定位。不过，我们还需进行更多的结构研究，以便阐明hAgo2的N结构域在siRNA介导的mRNA剪接中的作 用。
原文检索：
DinshawJ.Patel.(2014)Complete pairing not needed.Science,346:542-543.
筱玥/编译
------------本文摘自《生命奥秘》
Ago蛋白采取双叶支架的折叠形式，由 N端（N和PAZ结构域）及C端（MID和PIWI结构域）两叶组成。PIWI结构域为RNaseH折叠，它包括参与siRNA介导的靶标剪切的催化性酸 性残基。对嗜热栖热菌（Thermusthermophilus）Ago（TtAgo）二元复合物与引导链（此处指DNA）结合的结构学研究则发现了位于 两叶之间的核酸结合通道，其中，引导链已磷酸化的5’端位于Ago的MID结构域内，3’端则位于PAZ结构域。值得注意的是，引导链上2至6位的核苷酸 呈现出螺旋状排布，其碱基指向螺旋外侧，以便与靶标RNA配对。因此，这一螺旋结构组成了靶标识别的成核步骤。
后续的结构学研究则对 TtAgo与DNA引导链及靶标RNA（或DNA）结合在一起所组成的三元复合物进行了研究。这些研究明确了与催化循环中成核、扩展、剪切步骤相关的枢纽 样构象改变。在这些结构学研究中，研究人员使用不同长度的，与引导链种子片段（第2至8位核苷酸）、靶标剪切位点（第10和11位核苷酸）、以及增补片段 （第12至19位核苷酸）互补的靶标链。研究还确定了一对Mg2+及位于Ago蛋白PIWI结构域内的酸性残基在介导化学物质剪切方面的作用。从功能学的 角度看，DNA和RNA引导的原核细胞内的Ago都会参与防御可移动遗传元件（mobil egenetic elements）的过程。
siRNA 介导的靶标mRNA剪切需要引导链和靶标链精确互补配对，但与此不同，miRNA只需要引导链和靶标链在配对时横跨靶标mRNA的种子片段（核苷酸2至8 位），从而抑制翻译、导致降解。Dicer和Ago这两种酶类物质参与介导miRNA的生成，并将前体miRNA转化成为成熟的miRNA，随后成熟 miRNA被装载于Ago上。为了搞清楚miRNA介导的翻译抑制原理，研究者将针对原核生物Ago（pAgo）复合体的结构学研究，扩展到了真核细胞内 Ago（eAgo）的领域。这包括对hAgo2的二元复合物的研究以及与引导RNA链结合的芽殖酵母Kluyveromycespolysporus Ago（KpAgo）的研究。引导RNA链的种子片段——混合序列或者确定的序列——结合于eAgo复合物的两端，2号至5号核苷酸指向外侧，可与靶标 RNA配对，这一点与原核细胞内情况一致。此外，对与引导RNA结合的KpAgo二元复合物的研究发现了一个关键的谷氨酸，它与剪切元件的构象的形成相 关。这个氨基酸插入eAgo的“催化袋”内，从而形成完整的催化四合物（含有四个酸性残基）。
若要将这些研究扩展到三元复合物上，需要 Schirle等人获得并纯化得到毫克级的、结合于引导RNA某个确定序列的hAgo2，这样才能有足够的物质以制备、结晶三元复合物以及进行结构测定。 结构分析借助两个复合物的两组X射线数据（分辨率均为2.9Å）来完成，这两组数据分别为携带5’端磷酸化的引导RNA（长度为21个核苷酸）的 hAgo2二元复合物的X射线数据（图：二元及三元复合物，B），以及额外携带靶标RNA（长度为11个核苷酸）的三元复合物的X射线数据。在这个三元复 合物中，靶标RNA与引导RNA（分辨率为1.8to2.5Å）的2至7、2至8或2至9号核苷酸片段互补（图：二元及三元复合物，C）。
Schirle 等人的研究结果表明，有hAgo2参与的三元复合物形成的过程中，引导链-靶标链双链结构中的小沟形状互补，促进了复合体的形成，互补段跨越种子片段2至 7位核苷酸，此外，相互作用的Ago折叠中的疏水性残基也有助于该复合体的形成。这解释了为何种子片段区域的引导链-靶标链的错配会导致严重后果。与之相 反，如果错配发生在8和9位核苷酸，则无伤大雅。早期针对二元eAgo复合体的结构学研究，发现了在引导链第6和7号核苷酸之间存在一个扭结，这是源于来 自蛋白质螺旋α7的异亮氨酸残基的插入。令人吃惊的是，Schirle等人发现，一旦三元复合物形成，6和7号核苷酸就会形成堆叠螺旋的构象，α7结构则 有一个4Å的移动。这一改动才能使得引导链-靶标链双链结构得以存在于hAgo2折叠内。
hAgo2 双元复合物与确定序列引导RNA相结合的另一个引人注意的发现是，跨越14至18号核苷酸的引导链首次被检测到，此外，与预想一致，该复合体与引导链的两 端都结合，以及种子片段采取螺旋排列形式。14至18号核苷酸这一段序列，结合在N和PAZ结构域之间的一个狭窄通道内，由于其碱基指向内侧，因此无法进 行碱基配对。与之相对，一旦和靶标RNA一起形成三元复合物时，14至18位核苷酸片段就会出现巨大的构象改变，从原本的松散状转变为堆叠在一起，其碱基 指向外侧，以便进行碱基配对。
当hAgo2二元复合物变为三元复合物时，在引导链内所出现的显著的构象改变，促使Schirle等人对 miRNA靶标机制提出了一个逐步进行的模型，miRNA引导链首先对mRNA进行判断，通过种子2至5位核苷酸配对，鉴别出候选靶标位点。这一步触发了 hAgo2构象的改变，包括α7和PAZ结构域，种子片段6至8位核苷酸，以及增补片段13至16位核苷酸组成的螺旋结构中，碱基指向外侧，以便进行额外 的靶标识别。在这个模型中，9至12位核苷酸不参与碱基配对，说明这一片段内的退火对翻译抑制不起重要作用。因此，Ago2蛋白中跨越2至8号及13至 16号核苷酸的引导链-靶标链识别，避免了与核苷酸-结合通道内完全配对相关的拓扑学约束。
今后的工作中，将对更长的靶标RNA进行研 究，从而进一步观察在miRNA介导的hAgo2三元复合体内的引导链-靶标链配对情况，不仅仅局限于2至8位核苷酸，还包括13至16位核苷酸的片段。 此外，siRNA介导的剪切过程，需要靶标mRNA与hAgo2（hAgo1、hAgo3及hAgo4则不需要）精确配对的原因还未知。这样的剪切由 PIWI结构域内的RNaseH折叠参与，需要引导链和靶标链10和11号位的核苷酸的碱基配对，以及一对Mg2+和催化性四合体——由组氨酸及三个酸性 残基组成——在hAgo2剪切位点的精确定位。不过，我们还需进行更多的结构研究，以便阐明hAgo2的N结构域在siRNA介导的mRNA剪接中的作 用。
原文检索：
DinshawJ.Patel.(2014)Complete pairing not needed.Science,346:542-543.
筱玥/编译
------------本文摘自《生命奥秘》