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【平台介绍】lllumina高通量测序平台

2011-07-08 11:37阅读:
美吉生物拥有两台Illumina公司生产的新一代DNA高通量测序仪Genome Analyzer。该测序仪的核心专利技术是“DNA可逆性末端终止(reversible terminator,每次实验可以产生几十Gb到几百Gb的数据量,具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势。

【平台介绍】lllumina高通量测序平台

Illumina Solexa GA IIX 测序仪
技术原理
1. 文库制备
将基因组DNA打成几百个碱基(或更短)的小片段,并在两个末端加上接头(adapter)。
2. 桥式PCR产生DNA簇
Illumina高通量测序芯片表面连接有一层单链引物,两端连接测序接头的单链DNA片段通过与芯片表面的引物碱基互补结合,引物扩增成为双链后,使双链变性成为单链,该单链DNA的一端就被固定在芯片上,而单链DNA的另一端随机和附近的另外一个引物互补,也被固定住,形成桥(bridge。经过反复30轮扩增后,每个单分子得到了约1000倍扩增,成为单克隆“DNA
【平台介绍】lllumina高通量测序平台
3. 利用可逆化学阻断技术测序
利用边合成边测序(Sequencing by synthesis)的原理,加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是可逆终止子,其3’羟基末端带有可化学切割的部分,每个循环只容许掺入单个碱基。去除其他多余的dNTP后,用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。随后将这些基团化学切割,恢复3’端粘性,继续聚合第二个核苷酸。如此循环,直到每条模板序列都完全被聚合为双链。统计每轮收集到的荧光信号,就可得知每个模板DNA片段的序列。
4. 数据分析
自动读取碱基,数据被转移到自动分析通道进行二次分析。
【平台介绍】lllumina高通量测序平台
技术优势
1. 新颖的测序化学技术
Genome Analyzer利用新颖的可逆荧光标记终止子,可以在DNA链延伸的过程中检测单个碱基掺入。由于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存在,自然竞争减少了掺入的误差。
2. 可扩展的高通量
Genome Analyzer系统每次配对末端运行后可以得到超过20Gb的高质量过滤数据。这个技术的可扩展性保证了更高的数据密度和输出,能用更少的经费完成更复杂的项目。
3. 需要样品量少
Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中,如免疫沉淀、显微切割等。
4. 简单、快速、自动化
Genome Analyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程。样品文库制备可以在几小时内完成,一个星期内就能获得高精确度的数据。由独立软件控制的自动生成DNA簇的过程可以在5h之内(30min手工操作)完成。自动化的流程不需要进行油包水PCR,减少了手工操作误差和污染的可能性,不需要机器人操作或洁净室。快速地实验流程使Genome Analyzer的能力增至最大,而自动化降低了项目的时间和费用。
5. 单个或配对末端支持
Genome Analyzer系统支持单个片段或配对末端文库。文库构建过程简单,减少了样品分离和制备的时间。制备基因组DNA的单个片段或配对末端文库需要6h,手工操作只需3h
平台优势
1. 灵活的平台
针对不同的应用,可选择是否将不同的读取长度和对读测序技术相结合。
2. 高质量的测序数据
在每个流动槽中对数百亿到数千亿碱基进行准确的碱基识别。
3. 应用广泛
SNP和结构变异检测、(de novo)组装、转录组测序、甲基化检测。
4. 高效的样本制备
高速自动化工作流程以及低样品量要求,可在不到一周的时间内生成数据。
技术应用
1. 转录分析
1) mRNA测序(RNA-Seq
一次mRNA测序实验即能快速生成以完整poly A为尾的RNA完整序列信息,并分析基因表达、cSNPs、全新的转录、全新的异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录。
2) Small RNA深度测序
Small RNA测序能够测定来自不同有机体任意大小的小RNA序列,在一份样品中能同时分析4百万小RNA,是目前可应用的最广泛且最具深度的小RNA检测方法。Small RNA测序记录了文库群体中序列的数字频率,因此消除了本底信号。
3) 数字化基因表达谱分析
数字化基因表达谱通过高通量测序代表每个基因的21bp标签(tag)来快速、全面的检测一个物种特定组织在特定条件下的基因表达情况。因为标签测序无须测定表达基因的总长度,其总读取更少,敏感的更高,研究人员可在近乎不受限制的范围内调节覆盖的深度,完成罕见的转录识别和定量。
2. 基因调控和控制
Illumina ChIP-Seq整合了染色质免疫沉淀(ChIP)和海量平行DNA测序技术,可准确且低成本的识别和蛋白结合的DNA位点。ChIP-Seq技术为ChIP蛋白和修饰的研究提供了强大的技术支持。
ChIP法利用抗体中特定的蛋白,特异富集性交联的DNA-蛋白质复合体。然后将寡核苷酸接头与特异性蛋白结合的DNA延伸拼接,从而进行海量平行测序。按照片段大小进行选择后,使基因分析仪和Illumina测序技术对生成的ChIP DNA片段测序。与低分辨率的ChIP芯片技术不同,ChIP-Seq经一次测序就能准确地进行全基因组的关联分析。
3. 多重测序

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