碱性磷酸酶（ALP）的检测方法
2011-11-16 17:14阅读：
碱性磷酸酶（ALP）的检测方法
碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。
以ALP为目标物的检测方法有
1
Gomori钙钴法
2偶氮偶联法
3碱性磷酸酶染色试剂盒法。
4.PNPP偶氮法
5. BCIP/NBT比色法
6
茜素红法
7. von
Kossa法
1 Gomori钙钴法
【染色原理】 ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
【孵育液配制】 3%β-甘油磷酸钠 5ml
2%巴比妥钠 5ml
蒸馏水 10ml
2%
CaCl2 10ml
2%
MgSO4 1ml
【步骤】
（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，待细胞长满玻片后取出。
（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。
（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。
（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。
【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。
2
偶氮偶联法
【孵育液配制】
萘酚AS-BI磷酸盐 20mg
DMSO
0.5ml
0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2） 50ml
六偶氮副品红 0.5ml
1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。
（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）
【步骤】
（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃ 10%甲醛固定10min。
（2）蒸馏水冲洗。
（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。
（4）流水冲洗，晾干。
（5）甘油明胶封固。
【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。
3
碱性磷酸酶染色试剂盒法
【作用原理】
细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。
4.PNPP偶氮法
【步骤】
（1）用吸管吸掉96孔板内的培养液，用PBS冲洗3遍，加入含25mmol/L二乙醇胺，1mmol/L氯化镁和6.7mmol/L
PNPP的反应液。
（2）每孔150ul.37℃避光放置半小时,然后加0.1mol/L氢氧化钠100ul终止反应,用酶标仪于405nm波长下测定OD值.
（3）样品OD值在ALP标准曲线上读取酶活性值(U/L).
ALP标准曲线绘制:
取PNP0.0111克用三蒸水溶解后稀释至250ml,此时PNP的浓度为320umol/L.依次稀释到160 umol/L ，80umol/L,40umol/L,20umol/L,10umol/L和5mol/L.相当于ALP1280
U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶标仪于405nm波长下测定PNP的OD值.以ALP活性值作为自变量,对应的OD值作为应变量,求得直线回归方程.
【结果】测定碱性磷酸酶的含量
5.BCIP/NBT比色法
BCIP/NBT
（四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
【步骤】
1.
在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液
2.
室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至
