asy基因的克隆和pet32a载体表达实验材料和方法步骤

2013-05-20 10:07阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/2493467463

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒: 法夫酵母7B12、E. coli DH5α和BL21(DE3)由集美大学生物工程学院发酵研究室保藏; pACCAR16Δcrtx 质粒由德国Linden 教授馈赠[11]; pET32a载体价格650元，质粒购自Novagen 公司;pMD18-T 载体购自TaKaRa 公司。
1.1.2 主要试剂和仪器: TRI REAGENT 总RNA抽提试剂盒购自MRC 公司(美国); 5′-Full RACEKit 购于宝生物公司(大连); 质粒提取试剂盒、DNA marker DSTM 5000 购于东盛生物科技有限公司(广州); 工具酶均购自Fermentas 公司(加拿大); 氨苄青霉素、氯霉素、虾青素标准品、β-胡萝卜素标准品购于Sigma 公司(美国); IPTG 购自Biosharp 公司(美国); 色谱纯乙腈、甲醇、四氢呋喃购自TEDIA 公司(美国); 其它生化试剂为国产分析纯试剂。Eppendorf (德国) 5331 PCR 仪;Waters (美国) 1525 高效液相色谱仪; BIO-RAD(美国) PowerpacTM basic 蛋白电泳仪; 上海培清JS-680C 全自动凝胶成像分析仪; 宁波新艺JY92-IIN 超声波细胞粉碎机。
1.1.3 培养基和培养条件: Luria-Bertani (LB)培养基用于E. coli 的培养, 培养温度为37 °C; 麦汁培养基用于法夫酵母的生长, 培养温度为22 °C。LB 培养基(g/L): 胰蛋白胨10, 酵母浸膏5, NaCl10, pH 7.0; 麦汁培养基(g/L): 麦汁原液稀释至糖度为4° Brix, pH 6.0, 固体培养基加琼脂粉20。按照E. coli 的培养需要, 抗生素用量分别为: 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp) 50 mg/L, 氯霉素(Chloramphenicol, Cam) 34 mg/L。
1.1.4 引物: 根据已报道的法夫酵母asy 基因(Accession No. DQ002007.

1), 利用Primer Premier5.0 软件设计引物(表1), 其中3′ RACE R1 为逆转录引物, 3′ RACE R2、3′ RACE F1、3′ RACE F2和5′ RACE R1、5′ RACE F1、5′ RACE R2、5′ RACE F2 分别为扩增asy 基因cDNA 的3′端和5′端序列的引物, 3′ RACE R2、5′ RACE F2 扩增asy 基因全长cDNA, Full R、Full F 用于扩增asy基因的开放阅读框, 下划线部分为酶切位点。

asy基因的克隆和pet32a载体表达实验材料和方法步骤

1.2 法夫酵母asy 基因的克隆
1.2.1 法夫酵母总RNA 的提取: 根据TRIREAGENT 总RNA 提取试剂盒使用说明提取法夫酵母总RNA, 再将总RNA 反转录合成第一条cDNA 链。
1.2.2 asy 基因全长cDNA 序列的克隆: 以1.2.1得到的cDNA 链为模板, 扩增asy 基因cDNA 的3′端, 方法参照文献[12]。根据5′-Full RACE Kit 使用说明, 获得asy 基因cDNA 的5′端。接着以asy基因cDNA 的3′端和5′端序列为模板, 3′ RACER2、5′ RACE F2 为引物进行重叠PCR, 获得asy基因全长cDNA。重叠PCR 反应条件: 96 °C6 min; 94 °C 1 min, 50 °C 1 min, 72 °C 10 min; 一个循环后加入引物3′ RACE R2 和5′ RACE F2,96 °C 6 min; 94 °C 1 min, 62 °C 1 min, 72 °C3 min, 共30 个循环; 72 °C 10 min。将asy 基因全长cDNA 与T 载体pMD18-T 相连, 得到pMD18T-asy 质粒。
1.3 表达载体pET32-asy 的构建以质粒pMD18T-asy 为模板, Full R、Full F为引物, 扩增asy 完整开放阅读框序列。将扩增产物用BamH I 和Hind III 酶切, 然后与经同样限制性内切酶作用的载体pET32a 进行连接、转化,获得重组质粒即pET32-asy 。将pET32a 、pET32-asy 分别导入E. coli BL21(DE3)菌株中,利用Ampr 的抗性平板筛选, 得到BL21-pET32、BL21-asy 菌株。
1.4 重组蛋白的表达和可溶性检测培养BL21-asy 菌株, 当OD600 值达到0.5 时,加入0.5 mmol/L IPTG, 30 °C 诱导5 h, 以BL21(DE3)菌体, BL21-pET32 菌株诱导的菌体,BL21-asy 未诱导的菌体作为对照。取全菌进行SDS-PAGE, 检测融合蛋白的表达。收集BL21-asy 菌株诱导和未诱导的菌体, 采用超声波法破碎细胞, 破碎条件: 功率200 W、超声3 s, 间隔5 s, 冰浴超声10 min。离心提取上清,沉淀用8 mol/L 的尿素溶解, 离心再次取上清及沉淀, 将这些产物进行SDS-PAGE。
1.5 诱导条件的优化对BL21-asy 菌株进行诱导温度(16 °C−40 °C)及IPTG 浓度(0.1−1.1 mmol/L)的优化, 取未诱导的菌体做对照, 检测可溶性融合蛋白表达情况的方法参见1.4。
1.6 pET32-asy 与pACCAR16Δcrtx 的共转化将pACCAR16Δcrtx 质粒导入E. coliBL21(DE3)菌株中, 得到菌株BL21-Δ16, 再采取CaCl2 法将得到的菌株制成感受态细胞, 最后将pET32-asy 质粒转化到该感受态细胞中, 采用Ampr和Chlr的双抗性平板筛选, 得到共转化菌株BL21-Δ16asy。
1.7 类胡萝卜素产物的分析培养BL21-Δ16asy 菌株, 收集菌体( 以BL21-Δ16 的菌体为对照) 0.1 g, 加入1 mL 无水乙醇萃取, 离心, 取上清, 采用高效液相色谱法(HPLC)分析类胡萝卜素产物的种类, 方法参照文献[2]。
1.8 参数的计算根据SensiAnsys 凝胶图像分析软件扫描电泳图得到Asy 融合蛋白的灰度和菌体总蛋白的灰度, 以此计算Asy 融合蛋白的可溶性比例:Asy 融合蛋白的可溶性比例=100%×上清中Asy 融合蛋白的灰度/(上清中Asy 融合蛋白的灰度沉淀中Asy 融合蛋白的灰度)。

举报/Report

我的更多文章

下载客户端阅读体验更佳