奥林巴斯显微镜荧光的基本概念
2015-01-14 09:36阅读：
荧光是敏感，其中创建的物理（例如，光的吸收），机械（摩擦），或化学机制从电子激发态的分子发光的无处不在的发光过程家族的成员。通过由紫外线或可见光的光子的分子的激发发光发电的是这样一种现象称为光致发光，正式分为两大类，荧光和磷光，这取决于激发态的电子组态和排放路径。荧光是一些原子和分子的属性，在一个特定的波长吸收光，并随后经过短暂的时间间隔更长的波长的光发射被称为荧光寿命。发生的方法的磷光荧光的方式类似，但是具有更长的激发态寿命。
荧光的过程是由三个重要的活动，所有这些由几个数量级的（见表1），分离的时间尺度上发生。激发的易感分子由一个传入的光子发生在飞秒（10E-15秒），而最低能量级别的激发态电子振动弛豫是慢得多，并且可以测量在皮秒（10E-12秒）。最终的过程中，发射的较长波长的光子，并返回到基态的分子，纳秒（10E-9秒），在相对长的时间内发生。虽然整个分子的荧光寿命，激发排放，仅在十亿分之一秒，这种现象是一个惊人的表现，光与物质之间的相互作用形成的基础，广阔的领域的稳态和时间分辨荧光光谱仪和显微镜。由于极大地敏感排放概况，空间
分辨率和高特异性的荧光调查，该技术正迅速成为遗传学和细胞生物学的重要工具。
一些调查报告在十七和十八世纪的发光现象，但它是英国科学家乔治爵士G.斯托克斯荧光谁首先介绍于1852年，是负责铸造项荣誉的蓝白色荧光的矿物荧光（氟石）。斯托克斯还发现发射光谱的波长漂移到更大的值，他的名字命名。在二十世纪早期的一部分，由几个著名的科学家，其中包括8月克勒和卡尔·赖克特，最初报道的荧光是一个讨厌鬼，在紫外线显微镜的光学显微镜荧光第一次遇到。第一荧光显微镜由德国物理学家奥托·Heimstädt和海因里希·莱曼在1911年和1913年之间，作为一个分拆上市的紫外线仪器。这些显微镜观察到细菌，动物和植物组织的自体荧光。此后不久，斯坦尼斯拉夫·冯·Provazek推出了一个新的时代，当他用荧光显微镜来研究固定的组织和活细胞中的染料结合。然而，直到20世纪40年代初，阿尔贝浣熊开发出一种技术，用荧光染料标记抗体，从而造就了免疫领域的。到二十一世纪之交的，本场荧光显微镜在细胞生物学中的一场革命，负责特定的多个标签的单个细胞器和大分子复合物合成和基因编码的荧光探针耦合的力量，活细胞成像。
荧光过程的时间尺度范围内
过渡
|
过程
|
速率常数
|
时间刻度（秒）
|
S（0）=>
S（1）或S（n）
|
吸收（激发）
|
瞬间
|
10
-15
|
S（n）=>
S（1）
|
内部转换
|
K（IC）
|
10
-14到10 -10
|
S（1）= S（1）
|
振动弛豫
|
K（VR）
|
10
-12到10 -10
|
S（1）= S（0）
|
荧光
|
K（F）或Γ
|
10
-9至10 -7
|
S（1）=>
T（1）
|
系统间的隧道
|
K（PT）
|
10
-10至10 -8
|
S（1）= S（0）
|
非辐射
弛豫猝灭的
|
K（NR），K（Q）
|
10
-7至10 -5
|
T（1）= S（0）
|
磷光
|
K（P）
|
10
-3至100
|
T（1）= S（0）
|
非辐射
弛豫猝灭的
|
K（NR），K（QT）
|
10
-3至100
|
表1
荧光一般是与高度共轭的多环芳香族存在在几个能量水平在地面状态下，每一个与一个特定的安排的电子的分子轨道中任一项的分子研究。一个分子的负电荷的分布和整体分子的几何形状确定的电子状态。对于任何特定的分子中，存在几个不同的电子态（在图1中示出为S（O）
，S（1） ，S（2）
），根据总的电子能量和各种电子自旋态的对称性。的每一个电子的状态被进一步细分成若干与原子核和成键轨道的振动和转动能级。对于大多数有机分子的基态电子单中的所有电子的自旋配对（有相反的旋转）。在室温下，极少数分子存在于任何其他国家比基态的最低振动能级，从而有足够的内部能量，激发过程通常来自这个能量水平。
类分子能够发生电子跃迁，最终结果是已知的作为荧光探针，荧光染料，或仅仅染料荧光。荧光染料的共轭到一个更大的大分子（如核酸，脂质，酶，或蛋白质），通过吸附或共价键被称为荧光团。在一般情况下，荧光团被分成两大类，称为内在的和外在的。内在的荧光基团，如芳族氨基酸，神经传递素，卟啉，和绿色荧光蛋白，是那些自然发生。外源性荧光基团是人工合成的染料或修改的生化物质被添加到一个样本具有特定的光谱特性产生荧光。
吸收，激励和排放
发生在不同的分子轨道激发态之间的间隔紧密的振动和转动能级的荧光染料吸收的能量。有古典的雅布隆斯基能量图（见图1），命名荣誉的波兰物理学教授亚历山大·雅布隆斯基的各种能量水平参与的吸收和发射光的荧光。一个典型的雅布隆斯基图示出的单峰接地（S（0）
）的状态，以及第一（S（1）
）和第二（S（2） ）的激发单重态的水平线作
为堆栈。在图1中，较厚的线表示电子的能量水平，而较薄的线表示的各种振动的能量状态（旋转能量状态将被忽略）。作为直链或波浪形箭头所示状态之间的转换，取决于是否吸收或发射的光子（直箭头）或查询结果，从分子的内部转换或非辐射弛豫过程（波状箭头）与过渡。垂直向上箭头用来表示的瞬时性激发过程，同时保留更长的时间尺度上发生的这些事件的波浪形箭头。
吸收的光的发生非常迅速（约飞秒，所必需的时间为旅行单一波长的光子）在离散量称为量子和对应于从基态跃迁至激发态的荧光激发。同样地，通过荧光或磷光发射的光子在量子方面也被测量。量子中的能量（普朗克法）由以下方程表示：
E =hν =HC /λ
其中 ，E
是能量，h是普朗克常数，ν和λ是入射光子的频率和波长的，
和 c
是光的速度。普朗克定律决定的吸收的光子的辐射能量成正比的频率和波长成反比，即入射的波长较短具有更大的量子能量。的吸收一个光子的能量，它的发生是由于振荡与分子中的电荷（电子）的光波的电场矢量的相互作用，由荧光团是一个全或无的现象，并且可以只发生与入射光特定波长的吸收带。如果被吸收的光子包含更多的能量比为一个简单的电子跃迁是必要的，多余的能量通常被转换成振动和转动能量。然而，如果之间碰撞发生的分子和一个光子具有足够的能量，以促进过渡，不发生吸收。谱宽的吸收带产生紧密间隔的振动能量水平加上热运动，使一个范围的光子能量，以符合特定的过渡。由于激发的分子通过吸收通常发生在电子自旋配对而不改变，激发态也是一个单峰。在一般情况下，荧光调查工作是在辐射具有波长范围从紫外到的电磁波谱的可见光区域（250?700纳米）。
使用紫外线或可见光，常见的荧光团通常是兴奋较高振动能级（S（1）
）的第一或第二（S（2）
）的单峰的能量状态。之一的吸收（或激励）的转换示于图1（左手绿色箭头）的发生，从最低的基态的振动能级更高的振动水平的第二激发态（过渡记为S（O）
= 0?S（2） =
3）。第二激励过渡描绘从第二级的振动的基态的第一激发态的最高的振动水平（表示为S（0）
= 1
?S（1）=
5）。在一个典型的荧光基团，具有宽的光谱的波长的照射会产生允许的跃迁，填充的各种振动的激发态的能级的整个范围。一些这些过渡将具有高得多的程度的概率比其他人，并相结合时，将构成该分子的吸收光谱。请注意，对于大多数荧光，吸收光谱和激发光谱是不同的，但往往重叠，有时可能会变得难以区分。在其他情况下（例如荧光素，）的吸收光谱和激发光谱清楚地隔开。
紧随吸收一个光子，几个进程将发生的不同的概率，但最有可能将是最低的振动能量的第一激发态（S（1）=
0，图1）的水平的放宽。这个过程被称为作为内部转换或振动弛豫（光发射的情况下的能量损失），一般发生在一皮秒或更少。因为蒸发过程中激发态的寿命显着的振动周期，分子几乎总是进行完整的振动弛豫在他们兴奋的寿命。过量的振动能量被转换成热量，该热量被吸收由相邻的溶剂分子碰撞的激发态的荧光团时。
期间纳秒（时间最长的时期，在荧光过程由几个数量级）的顺序，最后才放宽到基态的激发态分子中存在的最低激发单重态（S（1）
）。如果从这个长期存在的状态是伴随着放松发射一个光子，这个过程是正式称为荧光。紧密排列的振动能级的基态，再加上正常的热运动时，在发射的光子能量，产生广泛。其结果，通常观察到荧光发光强度以上的频带的波长，而不是一个清晰的线。大多数荧光基团可以成千上万次重复的激发和发射周期数以百计的高反应性的激发态的分子是光致漂白之前，导致销毁荧光。例如，充分研究的探针的荧光素异硫氰酸酯（FITC）可以为约30,000个周期前的分子不再响应入射照明光进行激发和放松。
其他几个弛豫途径有不同程度的概率与荧光发射过程竞争。非辐射激发态能量可以消散热量（由青色波状图1中箭头所示），激发荧光团可以与另一分子碰撞，来传递能量的非辐射过程中的第二类型（例如，猝灭，如所指示的紫色波浪箭头在图1中），或者被称为系统间跨越的最低激发三重态能发生（在图1中的蓝色的波浪形箭头）的现象。后一种情况是比较少见的，但最终的结果无论是在发射的光子通过磷光或产生延迟荧光的激发单重态的过渡。禁止来自三重激发状态的转换到单线基态，这会导致在三重态发光的几个数量级低于用于荧光的速率常数。
三重态跃迁图解雅布隆斯基能量轮廓上的右手侧在图1中示出。间窜越低概率发生的事实，分子必须先经过旋转转换未成对电子，不利的过程。三重态的基本重要性是所表现出分子在该状态下，其结果往往是在漂白和生产造成的损害的自由基的化学反应性的高度。在生物样本中，溶解的氧是一种非常有效的在三重态的荧光的猝灭剂。这通常是一个三重的基态氧分子，可以激发单重态反应，导致的反应，漂白剂，荧光或具有活细胞光毒性影响。三重态的荧光基团中也可以直接与其它生物分子的反应，通常在这两个物种的失活所导致。分子中含有重原子，如卤素和许多过渡金属，通常方便系间窜越经常磷光。
从基态（S（0）
）发生的激发单重态（S（1）
）的过渡的概率取决于一个电子时，驻留在与那些的接地状态对之间的相似程度的振动和转动的能量状态目前处于兴奋状态，图2中列出的。图2中示出的Franck-Condon能量图呈现的振动能量的概率分布之间的各级在地面（S（0）
）和第一激发（ S （1）
）指出针对一种假设的分子。激发从地面到激发态的跃迁（红色线）发生在这样一个短的时间内（飞秒）的核间的距离与成键轨道不具有足够的时间来改变，从而转换被表示为垂直线。这个概念被称为“
弗兰克-康登原理。的最大吸收波长（红色线在中心）表示的最可能的核间距在基态到允许的振动能级处于兴奋状态。
在室温下，是不足够的热能，显着填充兴奋的能量状态和最有可能的电子状态是基态（S（O）
），其中包含了一些不同的振动能量状态，每个不同的能量水平。最被看好的过渡将是那些最大限度的转动和振动的电子密度概率重叠的基态和激发态（见图2）。然而，不同波长（与量子）的入射的光子可以具有足够的能量，以被吸收，并常常产生来自其他核间的分离距离和振动能级转换。这种效应引起到包含多个峰（图3）的吸收光谱。广泛的光子能量与吸收转换荧光基团，使产生的光谱显示为宽波段，而不是离散线。
假设的在图3中示出的吸收光谱（蓝波段）的查询结果从几个偏爱的电子从基态跃迁至激发的最低能量状态（标记为S（O）
，S（1）
，分别）。的吸收光谱是叠加在垂直线（黄色）代表从在基态的最低振动能级转换到较高的振动能级处于兴奋状态。需要注意的是过渡到最高的振动激发水平是那些发生在较高的光子能量（低级波长或更高的波数）。沿着上图3的横轴表示在电子伏特（eV）与转换相关的近似能量。还包括与态和激发态的振动能级沿右侧纵坐标。
通过荧光团的吸收光谱的扫描，同时记录在一个单一的波长（通常为最大发射光强度的波长）的发光强度，将产生的激发光谱。同样，令人兴奋的在单一波长（再次，优选的最大吸收波长）的荧光团，而通过扫描的发射波长将揭示的发光光谱的更新。可被视为概率分布函数给定的量子能量的光子将被吸收，并最终使荧光团发射的荧光辐射的形式的第二光子激发和发射光谱。
Stokes位移和镜像规则
如果仔细审核的荧光团的荧光发射光谱，几个重要的特点变得显而易见。作为快速的内部转换的结果，从较高的初始的S（1）激发态的最低振动能级的激发态的激发能量（波长）的发光光谱是
