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细胞活性测定方法汇总

2012-05-06 23:06阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/2769708724

细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、 3H 放射性同位素掺入法、 MTT 法等。其中 MTT 法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但 MTT 法形成的 Formazan 为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的 Formazan ，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如 XTT 、 CCK-8 （
WST-8 ）等。
现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：
1 、 MTT 法
MTT ：化学名： 3- （ 4 ， 5- 二甲基噻唑 -2 ） -2 ， 5- 二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（ Formazan ）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（ DMSO ）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内， MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于 MTT 经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。
2 、 XTT 法
XTT ：化学名： 2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide ，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臜产物。当 XTT 与电子偶合剂（例如 PMS ）联合应用时，其所产生的水溶性的甲臜产物的吸光度与活细胞的数量成正比。
优点： 1 、使用方便，省去了洗涤细胞； 2 、检测快速； 3 、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度； 4 、重复性优于 MTT 。
缺点： XTT 水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。
3 、 CCK-8 法或称 WST-8 法
CCK- 8 试剂中含有 WST – 8 ：化学名： 2- （ 2- 甲氧基 -4- 硝基苯基） -3- （ 4- 硝基苯基） -5- （ 2 ， 4- 二磺酸苯） -2H- 四唑单钠盐，它在电子载体 1- 甲氧基 -5- 甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（ 1-Methoxy PMS ）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（ Formazan ）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在 450nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
优点： 1 、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 2 、检测快速； 3 、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度； 4 、重复性优于 MTT ； 5 、对细胞毒性小； 6 、为 1 瓶溶液，毋需预制，即开即用。
缺点： 1 、与 MTT 相比， CCK-8 和 XTT 的价格比较贵。 2 、 CCK-8 试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。

LDH 释放法
酸脱氢酶（ LDH ）在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中 LDH 活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔 LDH 活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤 % 。本法操作简便快捷，自然释放率低，可用于 CTL 及 NK 细胞活性测定及药物、化学物质或放射引起的细胞毒性，现已有 LDH 法测定 CTL 活性试剂盒（ promega ）。应注意较高浓度 FCS 中所含 LDH 可能干扰结果。
51 铬（ Cr ）释放法，本法结果准确、重复性好，但也存在以下不足：①使用放射性的 51Cr 不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；② 51Cr 自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；③ 51Cr 半衰期（ 27.8 天），无法用于需多次测定的动物试验；④细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。
荧光测定法：
如： alamarBlue 一步荧光测定法
alamarBlue 为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。具体测定方法是：在靶细胞孔（ T ）、效应细胞孔（ E ）和实验孔（ T+E ）各加 alamarBlue ，共育 6 ～ 24h 后用板式荧光测定仪测 530nm （发射） /5

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