蛋白质超滤浓缩和换液
2013-11-04 16:49阅读：
1. 简介
超滤是下游工艺常用的压力驱动型膜处理技术，可进行蛋白质纯化、浓缩、换液、脱盐以及病毒清除等。超滤主要根据溶质的大小差异进行分离，即较大的物质被膜截留，而溶剂和较小的成分穿过膜孔，进入滤液。静电作用也会影响溶质的传递，如在较低的盐浓度条件下操作时，带电的溶质会被强烈的排除。
超滤膜可使用多种不同的聚合物制造，但其结构形式主要为平面膜和中空纤维。膜具有不对称的结构，且非常薄（厚度约为0.5μm），使其具有良好的选择性，而大孔的亚结构层可提供所需的机械强度和结构完整性。超滤膜平均孔径范围为10-500Å，但是生产商一般以截留分子量来对膜进行分级，其定义为具有特定截留系数（R）的溶质的分子量：R=1-CP/CF，其中CP和CF分别为滤液和进样料液中该溶质的浓度。数据一般以不同的模型蛋白或分散性葡聚糖测试获得。但是不同的生产商对截留分子量有不同的定义方法，包括溶质、缓冲液、流动状态以及截留率的选取，从而造成实际工艺研发的困难。
尽管小规模的超滤工艺可以通过死端过滤进行，但大规模的超滤工艺往往以切向流过滤模式进行，在这种操作模式中，料液平行于膜表面流动。在跨膜压的作用下，料液中的特定成分会穿过膜成为滤液（或透过液），而被膜截留的部分成为回流液。切向流动的料液会在膜表面形成“扫掠”，降低膜污染，增加滤液通量（单位膜表面积的滤液流速）。常规的超滤滤液流速范围为25-250Lm-2h-1（LMH）。常规的超滤跨膜压范围为0.2-4bar。
在超滤过程中，被截留的生物分子会积聚在上游膜的表面，形成浓差极化层。极化层会降低有效驱动压力，增加流动阻力，从而导致通量降低。此外，膜表面溶质浓度的增加会增加溶质传递的速率。在较高TMP条件下，当溶质浓度达到临界值时，通量（J）的变化将不受跨膜压的影响。该临界浓度（Cw）与蛋白的溶解度及渗透压效应有关。可通过简单的滞留膜模式估算在此条件下的通量：J=k
ln（Cw/Cb），其中Cw和Cb分别为膜表面和原溶液中的蛋白质浓度。质量传输系数（k）为膜表面溶质的反向传输速率。这是设备流体力学（如剪切）、溶液特性（粘度和扩散系数）以及组件几何学等相结合的功能效果。当通量与压力变化无关时，增加k值（如增加切向流速）或降低截留物质的总浓度可增加通量。
超滤常以批量模式进行。总的进料体积包含于循环罐内。通过膜处理去除滤液即可进行蛋白质的浓缩。批量操作的硬件要求较低，可进行简单的手动或自动控制，同时得到最高的滤液通量，但是，一般情况下，通过体积降低，很难得到较高的浓缩系数，而且在整个过程中，很难维持充分的混合搅拌。补料分批模式使用一个额外的储罐，向循环罐中补加料液。补料分批工艺相比批处理系统，可得到更高的浓缩因子，并提供更好的混合，增加多步工艺操作的灵活性。但是补料分批模式需要更长的处理时间，且与批处理模式相比，料液通过泵和阀的次数更高，增加了蛋白质变性和聚集的可能性。可使用洗滤进行换液和脱盐，在此过程中，小分子量成分被漂洗掉，同时向料液中补加新的缓冲液（或溶剂）。洗滤常以批处理模式进行，且洗滤缓冲液的补加以恒定的速率进行，以维持恒定的回流液体积。
2. 材料
超滤系统的常规组成包括料液罐、泵、膜组件、阀以及相关设备。系统一般完整成套销售，也可购买必要部件后，现场组装，但由于各厂家仪器兼容性的问题，一般不推荐做此处理。
2.1. 膜
超滤膜可采用不同的材质生产，其具有不同的表面化学和形态特性。纤维素（包括再生纤维素和纤维素酯）和聚砜（包括聚醚砜）最常用于生物工艺。许多膜在浇铸过程中或浇筑后会使用专利性化学处理进行修饰，所以实际的表面化学特性和表面电荷可能与原始膜有很大的差异。
进行膜选择时，一般建议选择高质量的供应商，因为稳定性和可靠性是生物工艺处理首要目标。最需要考虑的工程参数包括产物截留、工艺通量以及化学相容性。产物截留和工艺通量需要通过使用小规模设备处理实际进样料液来进行确定。但从经验上讲，膜的截留分子量至少需比待截留蛋白质分子量低2-3倍，以确保较高的回收率。膜的吸附特性对于工艺通量的确定也有一定的影响，但考虑到由于相对降低的结合常数（1-10mg/m2）以及生物工艺所需相对较小的膜表面积（0.01m2/g蛋白质）而导致的实际产物损失，这并不是非常重要的因素。与聚砜或聚醚砜相比，纤维素膜的结合率最低，但更易受极端温度或pH条件的损坏。
化学相容性既是进样料液的考虑因素，也是膜再生或清洗的考虑因素。通过评估储存一定时候后膜的产物截留及工艺通量特性，可确定膜组件在特定抑菌储存液中的长期稳定性。
2.2. 组件
市场上已有不同规格的组件可供选用，以达到所需的物质传递特性，并维持较高的膜包装密度。中空纤维和平面膜包是生物工艺最广泛使用的两种组件规格。中空纤维组件使用一系列具有细孔、自我支撑的纤维，末端以环氧树脂或聚氨酯灌封，并封装于塑料或金属外壳内。平面膜包将渗透网、膜、截留网以“三明治”的形式组合，网的结构确定膜上、下的流道特性，网在一定程度上可促进混合和物质传递。螺旋型组件也可提供有效的物质传递，但是该类设备容易被颗粒污染，且部件外部边缘与外壳之间的死腔很强清洗和灭菌。今年来，针对流体不稳定性或湍流，已开发有多种物质传递增强型组件，其中比较成功的是旋转柱状膜或快速旋转片，这些系统可以提供极高的滤液通量，但是包装密度较低，难以规模放大，且长期稳定性欠佳。
2.3. 料液罐
料液罐一般为圆柱状，但为了进行充分的混合，也也锥形底的料液罐提供，这样，即使回流液体积极低，也可以达到较高的工艺浓缩因子。回流液通过料液罐顶部的管路回到罐内，该导管应伸到料液罐的底部，以避免形成泡沫。可使用二级进样导管补加洗滤缓冲液或是清洗时循环滤液。必要时，可使用马达驱动的叶轮以进行充分的混合，转盘应置于锥形底部，以避免形成涡流。通常还需要一个独立的排水管道。还可以在料液罐的外围安装冷却水套，水套也可以用于维持清洗时所需的温度。于15psi以上压力条件下使用的容器（直径大于6英寸），需采用耐压材料。料液罐通常采用316L
不锈钢，以降低腐蚀，为改善性能，有时会使用机械抛光和化学处理。料液罐一般需要能测量液体水平、温度以及电导率。所以接头必需卫生、密封，确保系统无菌性及环境安全。
2.4. 泵
泵提供“切向流”以及所需的跨膜压。尽管离心泵成本较低，而可输送稳定、无脉冲的液流，但因为可能存在因磨损而形成的颗粒，所以在生物工艺中很少使用。滑动泵和齿轮泵由于会脱落颗粒，所以也因避免使用。带两个反向叶轮的转子泵使用较多，流体被吸入到叶轮外围，再从流出端寄出。叶轮间隔所需的严密性使转子泵相对较贵，但其卫生型设计和极低的颗粒形成特性对于生物工艺非常有吸引力。螺杆泵也较常使用，其原理是螺旋金属转子在弹性双螺旋缸体内转动。在蠕动转子泵中，泵通过连续挤压软管来驱动料液流动。而隔膜阀依赖于柔性膜片的前后运动，以形成高压，但流体的脉冲亦较高。
针对不同的应用可根据供应商的参考数据表选择合适的泵尺寸及马达，数据一般会包括在特定马达转速下的常规流速。
2.5. 阀
阀用于隔离溶液，控制流速和压力。一般隔膜阀使用较多，该类阀无空腔，可自排，且可通过阀盖与溶液隔开。阀体通常为316L不锈钢。隔膜阀采用TFE、EPDM或医用级硅胶制造。也可使用球阀和蝶阀。阀尺寸可根据所需的流速/压力进行选择。
2.6. 监测设备
TFF系统一般需要可在线监测流速、压力、温度以及液位。流速可使用转子流量计、电磁流量计或涡轮流量计进行测量。测量前，需使用实际工艺流体对流量计进行校准。温度可使用热偶电阻进行测量。同时可使用标准的压力计或传感器。液位通常使用浮子进行测量。
2.7. 溶液
清洗、消毒、除热源、储存、冲洗和预湿等操作都需要使用化学溶液。清洗通常使用氢氧化钠（0.1-0.5N）、次氯酸钠（300-500ppm）、硝酸（0.1N）、磷酸（0.1N）、柠檬酸（0.1N）、尿素（7M）或吐温80（0.1%）。最常用于蛋白质污染物的清洗剂是氢氧化钠和次氯酸钠。消毒可使用次氯酸钠（20-50ppm）、过氧乙酸（100-200ppm）、氢氧化钠（0.1-0.5N）或甲醛（1-2%）。除热源可使用氢氧化钠（0.1-0.5N）、次氯酸钠（600ppm）、盐酸（0.1N）或磷酸（0.1N）。常用的储存溶液为氢氧化钠（0.1N）、甲醛（1%）、叠氮化钠（0.05%）以及亚硫酸氢钠（1%）。由于膜材质和规格的差异，推荐使用的清洗和储存溶液可能会有所不同。超滤系统通常用超纯水浸润并冲洗，然后再用合适的缓冲液润湿，最后再进样。
3. 方法
3.1. 系统组装
TFF系统的组装需使用卫生型部件。连接部位常使用TC规格接头。对系统进行预清洗和消毒可去除微生物及热源。然后再用超纯水冲洗去除残留的清洗/消毒溶液。冲洗用纯水用量可按每平方米膜表面积10L的量进行计算，滤液和回流管路都需冲洗，然后排干冲洗用水。
3.2. 水通量测试
水通量是膜组件质量控制的重要参数，用于评估清洗后组件性能的恢复情况。水通量使用回流液和滤液的总循环进行测量。
1.
在标准操作压力和流速条件下，将水在系统内循环3-5min。
2. 记录滤液流速、水溶液温度以及进料、回流、滤液压力。
3.
滤液流速除以平均跨膜压降和膜表面积即为通量值，一般需使用粘度校正因子将该值标准化至25℃条件下计算值。
4.
将计算值与出厂规格及在特定膜使用和运行次数条件下的推荐值进行比较。
3.3. 完整性测试
膜使用前需进行完整性测试，可使用预湿膜空气流测试（或气泡点实验）。
1. 用超纯水冲洗膜和组件，排干回流管路。
2.
在组件的进样端口连接已知气源（一般推荐空气或氮气），调节气源压力至5psi。
3.
关闭回流阀，提高气源压力（如10psi），并使系统稳定（此时水流停止）。
4.
测量通过膜的空气流速（或可简单地将滤液管路置于水中，观察气泡形成）。
5.
将测量值与出厂规格进行比较，如流速很高，则说明组件损坏，需要更换（或滤液管路出口快速形成气泡，则说明组件损坏）。
3.4. 缓冲液预湿
如果直接加入超纯水中，某些蛋白质可能会变性，所以使用前需先排干超滤系统内的纯水，然后再用合适的缓冲液预湿。将缓冲液在系统内循环3-5min，保证系统完全润湿，然后排干系统，再泵入进料溶液。
3.5. 超滤/洗滤
TFF系统可用于浓缩和/或洗滤。操作开始时，滤液阀关闭，回流管路连接至进料罐。
1.
启动进样泵，缓慢增加至所需的流速。循环5min，以平衡系统。
2.
缓慢打开滤液阀，并同时调节回流阀，使跨膜压达到约5psi。
3. 缓慢调节跨膜压至所需的水平。
4.
将滤液管路连接至滤液罐，持续操作，直到达到所需的浓缩因子。使用相同的起始步骤，进行洗滤，洗滤缓冲液开始流动时，滤液阀打开。持续操作，直到达到所需的洗滤体积。
3.6. 产物回收
回路管路及组件内残留的产物可以通过泵入空气或氮气排出（泵入氮气可降低蛋白质氧化/变性）。向进样罐内加入新鲜的缓冲液，体积比系统滞留体积稍高。将滤液和回流管路连接至进样罐，在较低的泵速和TMP条件下在系统内循环缓冲液。向系统内泵入空气/氮气回收剩余的产物。
3.7. 系统冲洗
为防止残留蛋白质变性或沉淀，超滤系统清洗前，需先用缓冲液冲洗。将滤液和回流管路连接至进样罐，在较低的泵速和TMP条件下将缓冲液在系统内循环数分钟。排出缓冲溶液。
3.8. 清洗和消毒
清洗一般在40 –
60℃条件下进行，以促进污染物的清除。向进样罐内装入所选的清洗溶液，向组件内泵入约1/3的清洗溶液，并将回流和滤液管路直接连接至排水槽，排出溶液。再将回流和滤液管路连接至进样罐，在较高切向流速条件下，将剩余的清洗溶液泵入系统，循环30-60min。排干系统，并用超纯水浸洗。
3.9. 储存
向膜组件内泵入合适的储存溶液。排干系统。拆下膜组件，并存入充满储存溶液的容器内。
4. 注意事项
1.
污染物会严重影响膜的操作性能，导致通量降低，溶质截留增加。通过以下方式可在一定程度上降低污染：（1）使用低蛋白结合的膜；（2）在较低的TMP和/或较高的切向流速率条件下操作；（3）避免形成气体界面，如气泡或泡沫；（4）使用物质传递特性优良的组件。在起始操作时，缓慢地调节跨膜压也可以降低污染。有些超滤用户会在进样罐上覆一层氮气，降低蛋白质氧化，避免泵形成气腔，从而减少污染。污染的程度可通过测量膜的水通量来进行估测，该步骤可在用缓冲液冲洗组件之后、用纯水清洗组件之前进行。测试数据可用于处理条件的选择，以降低污染。
2.
进料溶液中污染物或盐离子的浓度会随着洗滤的进行而降低：CF=CFIe-N（1-R），其中CF0为起始污染物浓度，N为洗滤体积（等于总滤液体积除以回流液体积）。根据此公式，当洗滤体积达到6.9时，污染物的清除率可但99.9%，R=0。值得注意的是，即使某成分的分子量显著小于膜截留分子量，也可能是“非零”截留。荷电膜可通过Donnan排斥效应而截留污染物，污染物也可能通过与截留物质的交联作用而被截留。进料或洗滤缓冲液中的去垢剂可形成微粒，而携带小分子污染物。如进料罐中的搅拌或混合不够充分，也可能导致公式计算值的偏差。洗滤过程中，截留产物的产量（Y=CF/CFI）也可以通过该公式计算，此时R为产物的截留系数。
3.
浓缩过程中，回流液起始体积与终体积的比值成为体积浓缩因子X。给定浓缩因子下，产物产量可按一下公式计算：Y=XR-1，该公式也可用于浓缩操作后，污染物的浓度，即CF/CF0=YX。
4.
如果一个工艺需要浓缩和洗滤操作，那么工艺的总时间取决于进行洗滤的时间点。将产品先浓缩至特定特定体积浓度，在进行洗滤，这样可显著降低工艺时间，此浓度可按以下公式计算：Cb=Cw/e，其中Cw
为膜表面的蛋白质浓度。通过J vs
Cb的曲线图，可推算通量降至零时的Cw值。
5.
超滤工艺的研发设计到膜表面积、循环流速以及跨膜压力的选择。通量是跨膜压在不同的流速条件下一个功能值，所以可以据此选择切向流速和跨膜压。跨膜压通常根据压力偏离曲线进行选择。滤液通量一般会随切向流速（循环流速）的增加而增加，但这样就需要更大的泵及相关配件。溶质截留的测量对于切向流速及TMP的选择也很重要。一般情况下，滤液通量增加，产物截留降低，浓差极化程度提高。在较高的洗滤体积条件下，即使筛分系数（S=1-R）较低，也会导致显著的产物损失。膜表面的选择与要求的处理时间直接相关。大多数生物技术超滤工艺要求在3hr内完成，以方便工作安排，也可以降低蛋白质变性和降解的可能性。
6.
超滤工艺的规模放大要求使用相同的膜材质、孔径、组件结构、切向流速以及流道高度。膜面积随滤液体积呈正比放大。最有效的放大方式是线性放大，即改变操作规模时，保持压力、液体流速、浓度规格以及过滤组件的长度恒定。保持流道长度恒定，才能完成线性放大，鉴于流体清除以及摩擦压力的损耗，进样流道规格的变化会导致回流流速、浓度以及压力的变化。也就是说，膜表面积的增加可通过增加中空纤维或平行流道的数量来进行。物质传递增强型组件（如回旋流组件）由于系统结合学的限制，膜面积的线性规模放大相对困难。
7.
大多数超滤工艺在恒定的跨膜压条件下进行。但是对于特定的应用来说，很难维持TMP的恒定，不是滤液通量极低，就是污染较严重。在这种情况下，以恒定的滤液通量进行操作可能更有优势。在滤液
