化学反应IPC（反应中控）HPLC紫外检测波长选择的一些探讨
2018-04-29 09:50阅读：
【概述】化学反应过程的中控（In Process
Control）是否恰当不仅会影响产物的收率，还可能会生产一些十分难除去的杂质，直接影响产品的质量。中控就像是化学反应的眼睛，是了解一个化学反应进程的重要手段。在原料药及中间体生产过程中化学反应的中控都是十分重要而且必不可少的。化学反应中控的手段很多，有借助TLC(thin
layer chromatography)的、有借助GC的、有借助HPLC的。
HPLC方法由于能快速准确定量而被广泛使用，在开发HPLC的IPC（In Process
Control）方法的过程中，由于涉及到的化合物较多，有原料、中间态、产物、杂质，有些反应的原料或中间态可能还有好几个。HPLC紫外检测器，究竟选择哪个波长才能较为真实的反映出体系中的原料、产物、杂质的消耗及生成情况呢？
IPC方法开发的基本思路
分析方法开发者要和合成团队密切配合，要充分的理解化学反应，包括原料、产物的结构及理化性质，反应机理，有哪些中间态、理论上可能有哪些潜在杂质等。
【IPC方法的基本要求】
总的来说IPC方法要满足反应监控要求的情况下快速、直观。
满足反应监控要求：关注的目标化合物和之间要有必要的分离度。比如某个反应主要关注的是主原料和产物，也可能有数个1%以下的杂质生成，若杂质在后处理中很容易purge掉。那么就没有必要因为这几个杂质的分离度而开发一个分析时间过长的HPLC方法。杂质研究可以利用中间体控制方法进行专门的研究。
快速：建议开发的中控方法在10分钟内，尽量采用5cm甚至更短色谱柱。化学反应是一个动态过程，时间太长，不能及时的反映出体系的情况。有些反应本身就2-3小时能反应结束，如果中控是时间就用掉半个多小时，就相当于滞后半个小时，副产物或者杂质可能会增大，降低了生产效率，增加了产品质量风险。
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直观：中控方法不建议有复杂的计算过程，最好是定量稀释后采用面积归一法，直观，一目了然。中控过程中原料和产物是一个彼消此涨的过程，原料和产物的浓度变化范围较大，所以
合适的波长选择尤为重要。当响应因子一致时，面积归一化结果和真实含量测定的结果就较为接近。
质谱兼容性：开发的中控方法的色谱条件最好能上质谱分析，这方便后面杂质研究的相互印证。
关于紫外吸收波长选择的一些探讨
1、紫外直接叠加取波长交叉点探讨
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。
通过DAD直接提取紫图谱进行叠加。叠加波长的交叉点和浓度相关。如上图，绿线和蓝线是同一化合物不同的浓度，同一化合物具有相同的紫外吸收曲线（曲线轮廓），只是曲线上各点的吸收强度不同；红线是另一化合物的紫外线吸收曲线。在不同浓度时紫外吸收曲线的交叉点波长不同。如上图的223nm和227nm。
理论分析：根据Lambert-beer定律，A=E×C×L。
A表示吸收度；E为摩尔吸光系数或百分吸光系数，对于固定某一波长是一个常数；L是光路长度。
对于HPLC流通池，L是固定的。假设上述两化合物分别命名1和2，则：
A1=E1×C1×L;
A2=E2×C2×L;
满足波长交叉条件为系数度相同，即A1=A2
E1×C1=E2×C2
E1/E2=C2/C1
从上面公式可见，紫外吸收曲线的交叉和两个化合物的浓度比相关，只要两个化合物的浓度比反比于其某个波长的吸光吸收比，那么就有曲线交叉。同理，对于任何一个波长处，只要两化合物的浓度比等于其吸光系数比的倒是时，二者就有交叉。
所以理论上这种直接曲线交叉的波长可以是任意波长，交叉处和化合物浓度相关，
不能用做紫外吸收波长选取的依据。
2、紫外光谱normal size后波长叠加探讨。
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上述1的直接叠加法不可取，通常还有一种做法是采用normal size后叠加。normal size
后叠加通常是以最大吸收峰的吸收度相等作为放大比例。如上图的三条曲线，以最大吸收峰的吸收度为标准，加权放大后三条线基本重合。
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下图显示上述化合物不同浓度时和另一化合物紫外吸直接收叠加图。
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下图示某一浓度通过软件noraml size 后叠加。
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normal size 后的叠加选取波长理论分析：
绿色虚线是软件自动放大到和蓝线吸收度一致的模拟浓度。
A1峰=E1峰×C1虚×L
A2峰=E2峰×C2×L
A1峰=A2峰；
E1峰×C1虚×L=E2峰×C2×L；
C1虚=(E2峰×C2)/E1峰…
根据Lambert-beerr定律，A=E×C×L;假设绿虚指定波长吸收系数为E1;蓝线某波长的吸收系数是E2;符合虚线和蓝线波长交叉条件是：A1=A2
A1=E1×C1虚×L
A2=E2×C2×L
由上述带入计算：
E1×(E2峰×C2)/E1峰×L=E2×C2×L
E1/E2=E1峰/E2峰；
即：只要某一波长处两化合物的吸光系数比和其最大吸收处的吸光系数比相同，两化合物的紫外吸收曲线就有交叉点。这种选取波长的方法和浓度无关。但是有可能没有交叉点或者有多个交叉点（上面虚线的紫外吸收图和蓝线的紫外吸收图就有3个交叉点）。
探讨：E1峰和E2峰为常数，所以其比值也是常数，当该常数为1时，表示两个化合物在E1及E2交叉波长处的响应因子一致，面积归一化的结果和真实结果较为接近。当E1峰/E2峰不在0.9～1.1的范围内，通过这种normal
size后交叉选取波长通过面积归一法读取的结果和真实含量结果差别较大。
另外这种normal size后可能有多个交叉点或者没有交叉，所以通过这方式选取IPC方法紫外吸收波长也有诸多缺点。
3、定量稀释选择中控波长探讨。
较理想的情况是找出一个波长原料和产物的E(百分吸光吸收）一致，那么通过面积归一法读出的面积百分比和真实含量比也是一致的。
根据Lambert-Beer定量 A=E×C×L。
对于两个化合物不同波长处：
A1=E1×C1×L；
A2=E2×C2×L
所以当C1=C2时，紫外吸收图谱有交叉是A1=A2；
此波长处E1=E2，量化合物的响应一致。
具体实施：
- 将原料和产物分别稀释成相同浓度（如0.1mg/ml）HPLC进样分析，需要DAD检测器。
- 提取原料和产物峰顶点处的紫外吸收图，进行叠加，如果有交叉，那么该处的波长E1=E2，两化合物响应一致。
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探讨：定量等浓度稀释可能有一个或多个波长交叉点，或者很难找到合适的波长交叉点。
4、直接根据原料或产物的最大紫外吸收处Emax波长作为选取波长探讨。
探讨：当原料和产物具有相同的紫外发射基团时可以采用该方法，具体表现在原料和产物的紫外吸收轮廓一致，具有相同的Emax。通过计算校正因子或者外标法直接测定反应终点时原料的含量和面积归一化纯度的关系即可。
小结：
分析方法开发是一个理论和实践结合的过程，没有一个方案能解决所有问题。随着仪器的稳定性和精度的提高，很多老的经验和观念也在改变，比如中控方法更加追求快速、直观，检测波长的选择和最终API及中间体检测思路可能不一样，再加上现在的分析仪器的稳定性比从前大大提高，检测波长即使没有选择在峰或者谷处也能满足IPC要求。
【IPC方法紫外波长选择思路一】
1、确定反应控制的主要目的，反应主要监控的是原料还是中间态还是某个杂质，或者是以哪个为主。对反应的充分理解。
2、紫外吸收图的提取和叠加。
建议直接通过HPLC-DAD检测器进行提取相应化合物的紫外吸收图谱。有人用紫外分光光度计进行扫描，其实这样还是有细微差别的，尤其是在流动相进行梯度洗脱或者有添加剂时，化合物在流通池中被检测时的真实的流动相的比例对化合的吸收可能有红移或者蓝移的影响。
具体操作：
2.1 对反应的原料HPLC进样分析定位。
2.2
将反应进行到适当程度的反应液稀释并进样分析。这里最好不要取用刚开始反应的反应液，因为产物可能很少；也不要取反应快结束的反应液，可能原料或者中间态已经消失了。
2.3 提取主要关注化合物的紫外图谱。注意提取图谱的时候尽可能的提取浓度高处（靠近峰尖处）的紫外图谱。
2.4 图谱叠加。将关注的紫外图谱进行叠加。
3、叠加后图谱分析和波长的选取。
对于具有相同的紫外发射团的简单反应,直接选取最大吸收处。
对于原料和产物有不同发射团的，选取紫外吸收尽量平缓处。
对于有多个原料或者中间态及杂质都需要兼顾的，确定一个主要关注化合物，将主要关注的化合物和产物的紫外图谱进行分析，同时要兼顾其他需要关注的杂质；如果关注的其他杂质和原料及产物的紫外吸收相差实在太大，可以考虑采用DAD检测器，提取其他波长进行检测。
【IPC方法紫外波长选择思路二】
1、确定反应控制的主要目的，反应主要监控的是原料还是中间态还是某个杂质，或者是以哪个为主。对反应的充分理解。但是这种选取波长的方式主要是适合已知的原料作为主要的中控对象。
2、紫外吸收图的提取和叠加。
具体操作：
2.1 对各原料或产物分别进样定位。
2.2 对反应的一个或多个原料和产物分别或者一起配制成相同浓度的溶液（如果原料容易转化成产物就应该分开配制）。
2.3
HPLC进样分析。
2.4 提取主要关注化合物的紫外图谱。注意提取图谱的时候尽可能的提取浓度高处（靠近峰尖处）的紫外图谱。
2.5 图谱叠加。将关注的紫外图谱进行叠加。
2.6
关注的化合物紫外图谱和产物紫外图谱叠加图谱交叉处的波长选择为中控波长。
注，本文仅代表作者观点，如有异议欢迎探讨。
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