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实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）数据处理——相对定量△CT 和2-△△CT

2015-09-12 19:49阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/3850235290

一、实时荧光原理及其中的概念
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）作为分子生物学实验中强大快速的一种检测手段，已经被广泛应用于临床和普通实验室。废话不多说，简单介绍一下其原理，和两个基本概念Ct（Cycle threshold）和扩增效率，然后详细解释一下相对基因定量的方法。
实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。qPCR中常用的荧光染料为SYBR Green I ，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，因此在PCR每个循环的延伸(双链图2)过程中检测荧光信号，可以绘制原始的扩增曲线。如下图1：
实时荧光定量PCR（Quantitative <wbr>Real-time <wbr>PCR）数据处理——相对定量△CT <wbr>和2-△△CT


图1：PCR扩增曲线（注： Rn荧光信号量，n为循环数 ）
实时荧光定量PCR（Quantitative <wbr>Real-time <wbr>PCR）数据处理——相对定量△CT <wbr>和2-△△CT
图2 ：双链发射荧光


扩增曲线可以分为：图3
1. 基线期：-荧光信号在最初的数个循环里变化不大，接近一条直线，称为基线。
2. 对数期：-继基线之后，扩增进入到指数增长期，像细菌的繁殖曲线
平台期：-随着扩增的循环增加,引物,dNTP的消耗殆尽,不会再有新的DNA链产生了,就进入到平台期了
 实时荧光定量PCR（Quantitative <wbr>Real-time <wbr>PCR）数据处理——相对定量△CT <wbr>和2-△△CT

图3 扩增曲线的分期

实时荧光PCR中重要的概念：CT 、扩增效率
CT值（Cycle threshold value）：实时荧光PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数。起始模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。
扩增效率E（efficiency）：理想的PCR反应在指数期应该是Rn=R0 * 2n（Rn，n次循环产物量。R0，初始模板量。n，循环次数） 因为每扩增一次PCR产物就会变为上次的2倍。但是在实际PCR扩增中E基本在0.65-0.9。因此每个PCR反应的效率不一定都相同。因此，扩增公式可以写成 ：Rn= R0*(1+E)n

二、2-△△CT数据处理的方法
基因定量包括绝对定量和相对定量。绝对定量就是标准曲线法，这里不详细介绍，可以问度娘。绝对定量法比较费时费力，除了特殊情况，相对定量的方法也可以达到实验目的。在相对基因定量方法中，目前被广泛采用的就是2-△△CT法。用此方法有个前提，即目的基因（interest gene）和内参基因（endogenous control）有相同相近的扩增效率E。
附1：

扩增效率的推算：

1．公式法
实时荧光定量PCR（Quantitative <wbr>Real-time <wbr>PCR）数据处理——相对定量△CT <wbr>和2-△△CT 由公式（1） Rn= R0*(1+E)n



对（1）两边取对数得（2）： lgRn = lg (1+ E) • n +lgR0
n=CT时候，由（2）得（3） lgRct = lg (1+ E) • CT +lgR0

由（2）可知，lgRn为Y轴，n为X轴，作图可以看到lg(1+ E)即公式（2）的斜率S。因此得到 E = 10s-1


由公式（3）可知到达阈值时产物是一定定值的（阈值的定义）
lgRct = lg (1+ E) • CT +lgR0（3）
所以 ： lgR0是和CT 成正比的，这也是可以根据CT值判断初始模板量的原理。
2．观察法
观察目的基因和内参基因的扩增曲线，如果指数期的曲线形状一致，可以认为两个基因的扩增效率类似。这对于做很多基因的扫描绘制基因热图很实用也很简单，省去了每个基因的扩增效率的确定。如下图4
实时荧光定量PCR（Quantitative <wbr>Real-time <wbr>PCR）数据处理——相对定量△CT <wbr>和2-△△CT

图4 基因的对数期扩增曲线形状一致
附2：
上面的作为理解实时荧光PCR的基础，下面说一下具体试验中的应用


三、2-△△CT方法实用举例
例一
用药物处理肺癌细胞，计算处理对UTF-1 mRNA的影响。药物处理和未处理样品CT 值分别23.5 ，28.3。药物处理和未处理样品内参基因β-action的CT分别为19.5，21.3
处 理 组 △CT =23.5-19.5=4
未处理组△CT=28.3-21.3=7
△△CT=处理组△CT-未处理组△CT=4 - 7= -3
2-ΔΔCT=2-(-3) =8

药物处理UTF-1基因表达变化倍数=2-{[处理UTF-1CT-内参CT]-[未处理UTF-1CT-内参CT]}
=2-{[23.5-19.5]-[28.3-21.3]}
=2-(-3)

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