CRISPR／Cas的起源和原理
2016-05-06 01:28阅读：
CRISPR是什么？基因编辑的工具。
那么它的工作原理是什么？基因编辑的工具那么多，为什么CRISPR最近特别火？要理解这些，我们必须知道CRISPR到底是什么，这样才能理解它的潜力所在。
你猜我是怎么知道CRISPR这名词的？我搜王力宏竟然发现了这个：
人家搞演艺的在那里大夸张峰和CRISPR，我竟然不知道这是个啥。。。。好歹我也算个爱生物爱科研的实验狗啊。不能忍！
首先让我们来认识一下CRISPR的大名：CRISPR:
clustered
regularly interspaced short palindromicrepeats
(规律成簇的间隔短回文重复)
。换句话说你就明白了：CRISPR就是重复的DNA序列，只是重复得有规律有性格，人家是回文序列。
人家CRISPR也不是到处都有，主要在大多数的古细菌（90%）和细菌（40%）中存在。它们是这些细菌的获得性免疫系统的一部分［1］。
等等，你说什么？！细菌有获得性免疫系统？！细菌明明是单细胞生物，哪里来的B细胞T细胞，哪里来的抗体免疫？！
冷静冷静，这里的获得性，最好理解为记忆。CRISPR的大名里面有俩字：间隔。也就是说这些重复的DNA序列之间是有别的东西，这些别的东西就很有来头，它们不是细菌自己的，是那些曾经感染过这些细菌的噬菌体留下来的,我们管他们叫Spacer，间隔DNA。当这些噬菌体感染细菌，细菌跟它打了一架，即使胜利了也可能大伤元气，总得总结经验教训以后少吃亏不是，所以他们就把这些噬菌体DNA的一部分截下来，放到自己的DNA里面留个记忆。可是敌人总是多多的有，噬菌体A挂了，还有噬菌体B，C，D，F
。。。。
这么多教训要总结，做事总得有个条理，所以就有了这些CRISPR序列，用他们把不同的外源DNA分隔开。设想一个细菌的记忆库，里面是很多的小隔间，每个隔间里放着一段外来DNA，隔间之间的隔板相当于CRISPR序列。一旦有外物入侵，赶紧去记忆库里搜，要是发现敌人的DNA和记忆库里面有匹配的，对应的解决方法妥妥地有了，方便快捷。人类用抗体记忆病原表面蛋白特征，也有对应的抗体库，所以说CRISPR是细菌的获得性免疫系统的构成部分，是很有道理的。
到这里大家应该已经可以理解CRISPR所在的基因片断是这个模样：回文重复－外源DNA1－回文重复－外源DNA2－回文重复－外源DNA3－回文重复－外源DNA4－回文重复.。。大概就是这个鬼样子。但是还得额外加点东西：假设这些小隔间都处于一个大仓库里面，为了知道里面大概是什么东西，总得贴个标签好认路。所以最前面还得有个引导序列。因此CRISPR所在基因片断完整来看是这样的：引导序列—回文重复－外源DNA1－回文重复－外源DNA2－回文重复－外源DNA3－回文重复－外源DNA4－回文重复。。。
可是大家一说CRISPR总会顺便带上个Cas啥的，这个Cas又是个什么鬼？！作为一个完整的免疫系统，总不能光写记录不干活吧。所以Cas就是负责干活的功能蛋白。编码Cas蛋白的基因一般就在CRISPR序列的附近，即与CRISPR相关联（CRISPR-associated），所以称为Cas蛋白。这些Cas蛋白通常都是DNA解旋酶啦，核苷酸酶啦，聚合酶啦之类之类的，总之要是外来的DNA跟小隔间里的DNA配对上，Cas蛋白就冲锋上阵，把外来DNA该解旋的解旋，该切割的切割，该降解的降解。
可是不要忽略一个问题：这细菌把来自于噬菌体病毒等的外源DNA嵌到自己基因组里了，它会不会在那个位置把自己切了呀？答案是不会。因为细菌已经想好了办法，区分外面来的DNA和存在自己仓库小隔间的DNA。怎么区分呢？设想有两本一模一样的书，在噬菌体那里，完完整整，还有磁条；可是细菌拿到那本书以后，把磁条撕掉了。这样一来，两本书同时在细菌里面过机检测，只有从噬菌体来的那本书会搞到机子呱呱乱叫。在噬菌体或病毒的DNA序列里面，这个磁条就是一段只有几个核苷酸长度的DNA序列，称为PAM。在CRISPR系列里面，间隔DNA被称为Spacer，这个Spacer其实是来源于噬菌体或病毒的，也就是说它的原型（老家）在那边，所以噬菌体或病毒里跟Spacer一模一样的那段DNA被称为proto-spacer，即间隔原型序列。而PAM一般位于spacer附近，故称为“间隔原型序列邻近基序”（proto-spacer
adjacent motifs，PAMs)
。对于不同的细菌种类或Cas蛋白，PAM的序列会有所变化。PAM只存在于噬菌体或者病毒基因组里面，并且相对保守，所以细菌可以根据PAM可靠地认出外源DNA。PAM在细菌自己的基因组里面是没有的，因此不用担心切伤自己。
这样子就明白了，要有一个成功的免疫系统，你需要三样东西：在自身体内帮助记忆并认出外来DNA的CRISPR的序列，在外源物种体内用于区分敌我的特异保守的DNA短片段PAM，以及一些能发挥相应功能的酶Cas（通常不止一种）。所以一般并称CRISPR／Cas免疫系统。
那么具体怎么操作呢？
当噬菌体或病毒初次感染细菌（或者外源质粒输入），Cas功能蛋白识别PAM序列，截下一段DNA，并且将这段DNA插入到引导序列旁边，形成新的间隔序列和重复。比如原来是这样：引导序列—回文重复－外源DNA1－回文重复－外源DNA2－回文重复－外源DNA3－回文重复－外源DNA4－回文重复。。。；加了新的就变成了这样：引导序列—“新回文重复－新外源DNA”－回文重复－外源DNA1－回文重复－外源DNA2－回文重复－外源DNA3－回文重复－外源DNA4－回文重复。。。这就是记忆存储的部分。
当噬菌体或病毒第二次感染细菌（或者外源质粒再次输入），细菌基因组会将CRISPR一众序列全部转导出来，形成pre-crRNA;
经过相应的Cas功能蛋白处理后，形成单个的crRNA，“回文重复－
外源序列－回文重复”，这样没那么长，就可以轻松愉快赶紧去配对了；如果crRNA找到了配对的DNA序列，二者形成双链，同时Cas功能蛋白识别到PAM序列，确认外来病原再次入侵，那它们就会果断采取行动，把外源DNA切割，降解。。。各种处理让它们无法肆虐。
这样子就明白了，要做基因编辑，你需要三样东西：外源导入的用于识别目的DNA片段的类似CRISPR的序列，存在于目的细胞或动物基因组内用于帮助Cas蛋白特异性识别的DNA短片段PAM，和一些能发挥相应功能的Cas酶。因为Cas9这酶好用，所以常用CRISPR／Cas9基因编辑系统。
然后你就可以想到：可能限制这个系统的，应该就是PAM在目的细胞／动物的存在是否广泛，PAM是否能与目的基因片段搭配，可使用的Cas蛋白与PAM的配合，Cas蛋白的功能单双链切割／修补。。。当然还有作用效率等等。
这些以后再说。写这么多，累。来个总结图。来源自参考文献［1］。
参考文献：
［1］Horvath, P., & Barrangou, R. (2010).
CRISPR/Cas,
the immune system of bacteria and archaea.
Science,
327(5962), 167-170. doi: 10.1126/science.1179555
