生物明场显微镜基本原理

2020-03-07 14:05阅读：

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最常见的普通生物显微镜即为明场光学显微镜。成像光源为反射的自然光或电光源，光线透射标本后，经透镜组折射放大成像，借此观察标本内部的显微结构。明场光学显微镜用于观察染色的标本薄切片。

（一）普通生物显微镜的结构及光路
普通生物显微镜的结构由3套系统组成：光学系统、照明系统和机械系统。如下图，聚光器、物镜、目镜以及显微镜内部平常我们看不到的光学器件，属于光学系统，是决定显微镜成像质量的最关键部分。光源和反射镜属于照明系统。20世纪80年代以前大多采用自然光照，通过平面或凹面镜反射提供照明。该方式光色纯正，照明系统的故障率低，但对观察场所的要求高，须靠近窗户或配备日光灯。现在绝大多数显微镜采用电光源照明，操作更灵活，照明系统的故障率则升高，光色变化对图像分析有一定的影响。镜座、镜臂、载物台等属于机械系统。虽然不直接参与成像，但精良的制造加工水平和材料的耐用性，是长期准确成像的重要保障。

生物明场显微镜基本原理

（普通生物显微镜的结构模式）

（1）物镜。
物镜（objective）在光学显微镜中是最重要的部件，其性能参数与成像质量的关系最密切。普通生物显微镜的质量和水平，主要通过物镜的效能来体现。物镜镜身上的铭文显示了该物镜的主要光学性能参数，例如下图。其中，首行为消除成像伪差的方式（见下文）。“63×”为放大倍率，“1.3”为数值孔径（numeral aperture）或称镜口率，这两个参数共同决定该物镜能以多大的放大倍数清晰观察物象。可以这样理解：数值孔径越大，通过单位面积的光线信息越多，物象的细节就越清晰。“∞”代表无限远光学系统；“0.19 – 0.15”为盖玻片的厚度范围，单位为毫米。

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（物镜的性能参数及一般标识方法）

（2）聚光器。
聚光器的作用是将发散的光聚集到标本，产生与物镜相适应的光束，形成明亮均匀的视场。聚光器作用不可忽视，它与光阑配合调节，关系到成像的分辨率、对比度、景深和亮度（见小标题“照明和聚光器的原理”）。
（3）光阑。
光阑控制着显微镜入射光路的性质，分为视场光阑（field diaphragm）和孔径光阑（aperture diaphragm）。视场光阑在普通生物显微镜通常位于底座光源出口，调节视场的照明范围，控制视野；孔径光阑一般与聚光器连在一起，须根据不同物镜的实际数值孔径进行调节（图1-3）。光阑的作用是控制光路，而非调节亮度；后者应通过调节光源来实现。

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（聚光镜和孔径光阑）
（4）目镜。
目镜（eyepiece）位于光路的末端，用于最后一级放大，供人眼观察。目镜只起放大作用，对提高显微镜的分辨率无贡献。有的目镜中有内置的测微标尺或指针，可方便地进行测量和示教。
显微镜的总放大倍率＝物镜放大倍率×中间镜放大倍率×目镜放大倍率。由于中间镜产生的放大倍率一般用户并不清楚，且屏幕显示或纸张打印时尺寸会进一步改变，故记录和报告显微图像时，采用诸如“400×”的形式并不准确。

（二）光学伪差
通过透镜折光进行放大成像的光学设备，均存在光学伪差。显微镜透镜的光学伪差主要为球面像差（spherical aberration）和色像差（chromatic aberration）。
（1）球面像差。
球面像差是指单色光因为在透镜边缘区和中心区的折射角度不同，边缘区折射角大于中心区，聚焦时不在一点上而形成的伪差（下图）。球面像差的消除依赖无色差透镜，同时需要以特定的距离准确地同轴排列这些透镜。现代显微镜的物镜几乎均有消除球面像差的设计，内部固定着多重透镜，称“平场”物镜。因此，物镜需要妥善维护，尤其应避免摔落在硬物上。
（2）色像差。
当成像光束为混合色光（如白光）时，由于波长不同而折射角不同，聚焦时不同色光不在一点上。这就是色像差。消除色像差的基本方式是在凸透镜的后面同轴排列一个用折光和色散能力更强的玻璃材料制成的凹透镜，利用后者的反向色散加以纠正，称“消色差”透镜。因此，物镜内部的多重透镜中，既有凸透镜，又有凹透镜（下图）。

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（球差和色差的产生原理以及平场消色差物镜的剖面结构）

此外，透镜的光学伪差还有场曲（过大的标本聚焦成像于曲面所致）、像散（大角度光线两次成像不重合）、彗差（透镜光轴以外的点光源造成的靠近光轴部分的物像小、远离光轴部分的物像变大的现象）、畸变（通常由透镜曲率不均或形状不规则造成）等等。如果对此感兴趣，可进一步查阅光学的专业书籍。

（三） 照明光源的类型
电光源显微镜的照明光源，主要有卤素灯（halogen lamp）、汞灯（mercury vapor arc-discharge lamp）、氙灯（xenon short arc plasma lamp）和发光二极管（light-emitting diodes，LED）等类型。如下图，其中，卤素灯的连续光谱主要分布在可见光的暖色区，是传统生物显微镜的主要照明光源，使用时要配备蓝色滤光片矫正光色。汞灯为非连续光谱，主要发射光谱分布在紫光和绿光附近，一般用于荧光显微镜照明。氙灯与汞灯相比，虽然红外部分占比较高，但可见光区的连续性较好，对需要多色荧光激发的实验更适合。LED光源也非连续光谱，但在多个光色范围内都有发射光谱分布，并具有发热少、寿命长等优势，故可应用于多种类型光学显微镜的照明。

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（常用显微镜照明光源及其光谱分布特点）
（四）照明和聚光器的工作原理
现代明场光学显微镜的透射照明光路都采用了柯勒照明（Köhler illumination）的方式。该照明法由19世纪末蔡司公司的工程师奥古斯特·柯勒发明，很快在全球推广应用。过去显微镜的照明光路与幻灯机、电影胶片放映机等的光路相似，虽然亮度损失小，但光源物象（如白炽灯的灯丝）与标本物象重合，不易使整个视野均匀如一；长期强光照明还有可能灼伤标本。柯勒照明的主要改进是：光源发出的光经过光源聚光镜和可变视场光阑后，在聚光器孔径光阑处形成第一次光源物象；其第二次物象位于物镜后焦平面，从而使光源物象与标本物象分开（下图）。柯勒照明的优点是影像背景均一，光源的热焦点不在标本的观察平面，长期观察不会灼伤标本。此外，聚光器可将视场光阑成像在标本的观察平面，通过改变视场光阑大小可直接控制照明范围。

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(科勒照明光路示意图)

因此，使用显微镜前应根据柯勒照明的原理对照明光路进行调节。方法是：
取一张试样切片，在低倍镜下聚焦清楚；
→ 将视场光阑调至最小，上下调节聚光器，直至视场中光阑边缘清晰成像；
→ 调节聚光器对中旋钮，使光阑位于视野中央；
→ 放大视场光阑，调节至光阑像与视野外切；
→ 每次更换其他物镜，都应根据物镜数值孔径值调节聚光器的孔径光阑数值（物镜数值孔径值×0.7，聚光器上通常标有刻度；为得到较大景深，可稍缩小孔径光阑）。

㈤光学显微镜的日常使用和维护
显微镜属于精密设备，规范的操作和恰当的保护对提高观察精度和延长使用寿命有重要作用。光学显微镜有3处最容易出问题的地方：光轴精确性、光路洁净度和光源。针对这3个方面做好日常使用和维护，可确保设备长期保持良好的状态。
显微镜光轴指光源发出的光经过的一条准确的轴线，这条轴线上有聚光器、标本、物镜、中继镜和目镜等。其中，聚光器、标本（载物台）的位置可调节，而物镜、中继镜和目镜之间的位置是出厂时校准的，平时不能改变。另外，即使聚光器可调整，但光源—聚光器的位置如果偏移太多，也会导致物镜成像不准。因此，显微镜一般都有结实的镜身材料，防止各部位发生形变。搬动显微镜时，务必一手握紧镜臂，一手托住镜座（图1-1），同时用力抬起整个显微镜，移动到目的位置后轻轻放下；大型显微镜还应增加人手稳妥地托住镜座。不可单手抓住镜臂提起（大型显微镜尤应禁止这种操作）。搬运过程中切不可碰撞其他物体，轻抬轻放，避免造成光轴对位不准。
光路污染是长期使用后造成不少显微镜成像质量下降的常见原因。污染物常见的有灰尘、油渍和霉菌。灰尘污染主要存在于光源聚光镜/滤光片处和聚光器最上方的镜片，长期使用而不清洁的情况下易出现。一般表现为照明亮度不足，用软布、擦镜纸或棉签简单擦拭后即可解决。使用后待显微镜光源冷却，要及时盖上防尘罩。油渍常见于高倍物镜镜头（外侧）和目镜前的最后一个中继镜的上表面。物镜镜头的油渍通常是镜油使用不当造成的其他倍数物镜的污染，表现为成像始终模糊或浑浊。油镜使用后未及时清洁，本身的成像也会浑浊。新近污染的，用擦镜纸反复擦拭可已解决；陈旧性油渍污染，可蘸少许二甲苯快速擦拭（不要一直用二甲苯），然后按常规方法处理。目镜前的中继镜污染物则一般是由于取下目镜转接其他光学设备的操作造成的。取下目镜后该区域开放，灰尘、转接口的油性物质等均可沾染。此时应采用优质棉签（不可有残留物脱落）蘸乙醇-乙醚1꞉1（v/v）混合液以从心逐渐向外画圈涂擦的方式清洁（下图）。一次未能完全洁净，可换新棉签蘸液再擦。不要来回擦拭，那样只是将污染物带到别的位置，但不能清除。

生物明场显微镜基本原理

(透镜表面污染物的擦拭方法)
光路污染中，由霉菌造成的污染最为棘手。霉菌孢子可能沿任何空隙沾染显微镜内部的镜片，生成霉点、菌丝等，产生明显的背景杂质。如果经同一台显微镜成像，不论何种标本，背景同一位置都有暗的点状、条状或片状阴性，处理了能接触到的镜片后仍不能解决问题的，很可能就是霉菌污染。这种情况一般需要联系显微镜制造厂的专门技师，拆开后才能处理。所以，预防十分重要。不要把显微镜置于频繁用水或进行液体加热操作的房间中；空气湿度较大的地方，应开启空调的除湿功能，或使用空气干燥设备；在显微镜室安置红外灯，也可有效杀灭真菌。
过去的反射光显微镜不受光源故障的困扰。电光源显微镜中，光源故障是出现频率最高的问题之一。卤素灯的寿命相对较短（3 ~ 5年），平时一定要有相同型号的备份，随时准备更换。高压汞灯的寿命更短（累计约300 h），虽不至于随时可能报废，但实验室也应常备多个，避免工作中断。为了维护电光源，延长使用寿命，应做好两个方面。其一，把光亮度关到最小再接通显微镜电源，避免开机时电流冲击发光元件造成损伤；关机时也要先调暗光源再断电。其二，整理好待检标本，有计划、有目的地观察和采集图像，避免因搜寻目标结构而长时间保持高照明强度，或因计划不周而反复开关光源。

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