一、实验目的
1、了解革兰氏染色原理并掌握其操作。
2、巩固无菌操作技术及显微镜使用方法。
二、实验原理
革兰氏染色法能将细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。在用乙醇进行脱色时，两种菌的细胞壁结构不同，阳性菌细胞壁为网状结构，比较厚，结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，而阴性菌细胞壁比较薄，颜色更容易洗脱出来，所以最终革兰氏阴性菌为红色，阳性菌为紫色。
三、仪器、试剂与材料
1、菌种：枯草芽孢杆菌和
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一、实验目的
1、了解革兰氏染色原理并掌握其操作。
2、巩固无菌操作技术及显微镜使用方法。
二、实验原理
革兰氏染色法能将细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。在用乙醇进行脱色时，两种菌的细胞壁结构不同，阳性菌细胞壁为网状结构，比较厚，结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，而阴性菌细胞壁比较薄，颜色更容易洗脱出来，所以最终革兰氏阴性菌为红色，阳性菌为紫色。
三、仪器、试剂与材料
1、菌种：枯草芽孢杆菌和
大肠埃希氏菌属25922。
2、染色液和试剂：结晶紫、碘液、番红、95%的乙醇、沙黄、香柏油、二甲苯、蒸馏水。
3、器材：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、滴管、吸水纸
四、实验步骤
1、染色步骤
（1）制片：接种环蘸取细菌液置于载玻片，酒精灯外焰加热玻片进行细菌固定。
（2）初染：添加结晶紫染色，1min后倾去染色液，蒸馏水冲洗至无色。
（3）媒染：吸干残留蒸馏水后，加入一滴碘液，作用1min，水洗。
（4）脱色：吸干残液后，加入95%酒精进行脱色，30s后水洗。
（5）复染：吸干残液后，用番红液复染，1min后，水洗。
（6）镜检：吸干残液后，低倍镜寻找目标物体，再用高倍镜放大目标物，目标视野添加香柏油进行观察。
2、平板划线
（1）左手中指、无名指和小拇指托住无菌平皿。
（2）盖子用食指和拇指掰开，右手持接种环进行第一区划线。
（3）酒精灯灼烧接种环至通红，晾凉后进行第二区划线
（4）重复（3）进行第三、四区划线
（5）将平皿置于适宜温度的培养箱培养过夜。
五、结果与讨论
1、革兰氏染色结果
图1为显微镜下的染色结果，从结果可以看出，这是革兰氏阳性菌，也就是我们所用的实验材料之一枯草芽孢杆菌，不过红色比较零星，这可能是因为我们
在清洗载玻片的时候不小心清洗过度，将一部分细菌冲洗掉了，所以效果并不是很好。
而我们所用的另外一个实验材料大肠埃希氏菌属25922理论上说应该是革兰氏阴性菌，这也就意味着最终显微镜下看到的颜色应该是紫色，但是试验最后我们只观察到一片白色，回过头来思考原因，这可能是因为我们在吸干载玻片的过程中用力过猛用纸巾把细菌给擦去了，所以最后细菌都没了，也就没有染上相应的颜色。
2、平板划线结果
下图为平板划线结果，从结果看，上方的划线是较为失败的，菌落都堆在了一起，没有得到足够的单细菌菌落，而下方的划线结果则相对理想一些，因为得到的单细菌菌落相对更多，但同时也存在很多黏在一起的菌落，这是比较失败的一个部分，反思原因，可能是因为划线的时候重复涂抹了太多次，搞得细菌都重叠到了一起，下次划线的时候一定要加倍注意，努力画出更符合标准的菌落。
3、讨论：
a、革兰氏染色的关键步骤是什么？为什么？
答：关键步骤是酒精脱色，因为若脱色过度，则阳性菌会被误认成阴性菌（都为紫色）；脱色不足，则阴性菌会被误认成为阳性菌（都为红色）。
b、造成革兰氏染色结果不正确的原因有哪些？
答：（1）细菌涂片太厚太浓使得细菌重叠，脱色效果不好会造成假阳性。（2）乙醇脱色过度造成假阴性，脱色不足造成假阳性。（3）所用细菌所处时期不对，如菌龄过老、死亡或细胞壁受损伤的阳性菌也会呈阴性反应，所以实验过程要使用对数生长期的幼龄培养物。
c、划线完毕后，平皿为什么要倒着放？
答：最主要的原因是防止空气中的细菌沉降至琼脂上造成污染，某些情况下也可以防止水份过多时污染菌顺着侧壁流进琼脂里。此外，培养箱的温度一般都比较高，而水汽的蒸发方向是向上的，因此倒置平皿不会失水过多，可以延缓干燥速度。
六、注意事项
1、细菌涂片不宜太厚，否则细菌容易重叠，影响脱色效果。
2、火焰固定不宜过热，做到玻片不烫手背即可。
3、乙醇脱色是关键操作，脱色过度阳性菌会被误染成阴性菌，脱色不足，阴性菌会被误染成阳性菌。
4、划线的时候要做到无菌，盖子尽量往平皿一边放，不要置于平皿的正上方，避免误染等，手在进行操作时要先用酒精消毒。
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2、染色液和试剂：结晶紫、碘液、番红、95%的乙醇、沙黄、香柏油、二甲苯、蒸馏水。
3、器材：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、滴管、吸水纸
四、实验步骤
1、染色步骤
（1）制片：接种环蘸取细菌液置于载玻片，酒精灯外焰加热玻片进行细菌固定。
（2）初染：添加结晶紫染色，1min后倾去染色液，蒸馏水冲洗至无色。
（3）媒染：吸干残留蒸馏水后，加入一滴碘液，作用1min，水洗。
（4）脱色：吸干残液后，加入95%酒精进行脱色，30s后水洗。
（5）复染：吸干残液后，用番红液复染，1min后，水洗。
（6）镜检：吸干残液后，低倍镜寻找目标物体，再用高倍镜放大目标物，目标视野添加香柏油进行观察。
2、平板划线
（1）左手中指、无名指和小拇指托住无菌平皿。
（2）盖子用食指和拇指掰开，右手持接种环进行第一区划线。
（3）酒精灯灼烧接种环至通红，晾凉后进行第二区划线
（4）重复（3）进行第三、四区划线
（5）将平皿置于适宜温度的培养箱培养过夜。
五、结果与讨论
1、革兰氏染色结果
图1为显微镜下的染色结果，从结果可以看出，这是革兰氏阳性菌，也就是我们所用的实验材料之一枯草芽孢杆菌，不过红色比较零星，这可能是因为我们
在清洗载玻片的时候不小心清洗过度，将一部分细菌冲洗掉了，所以效果并不是很好。
而我们所用的另外一个实验材料大肠埃希氏菌属25922理论上说应该是革兰氏阴性菌，这也就意味着最终显微镜下看到的颜色应该是紫色，但是试验最后我们只观察到一片白色，回过头来思考原因，这可能是因为我们在吸干载玻片的过程中用力过猛用纸巾把细菌给擦去了，所以最后细菌都没了，也就没有染上相应的颜色。
2、平板划线结果
下图为平板划线结果，从结果看，上方的划线是较为失败的，菌落都堆在了一起，没有得到足够的单细菌菌落，而下方的划线结果则相对理想一些，因为得到的单细菌菌落相对更多，但同时也存在很多黏在一起的菌落，这是比较失败的一个部分，反思原因，可能是因为划线的时候重复涂抹了太多次，搞得细菌都重叠到了一起，下次划线的时候一定要加倍注意，努力画出更符合标准的菌落。
3、讨论：
a、革兰氏染色的关键步骤是什么？为什么？
答：关键步骤是酒精脱色，因为若脱色过度，则阳性菌会被误认成阴性菌（都为紫色）；脱色不足，则阴性菌会被误认成为阳性菌（都为红色）。
b、造成革兰氏染色结果不正确的原因有哪些？
答：（1）细菌涂片太厚太浓使得细菌重叠，脱色效果不好会造成假阳性。（2）乙醇脱色过度造成假阴性，脱色不足造成假阳性。（3）所用细菌所处时期不对，如菌龄过老、死亡或细胞壁受损伤的阳性菌也会呈阴性反应，所以实验过程要使用对数生长期的幼龄培养物。
c、划线完毕后，平皿为什么要倒着放？
答：最主要的原因是防止空气中的细菌沉降至琼脂上造成污染，某些情况下也可以防止水份过多时污染菌顺着侧壁流进琼脂里。此外，培养箱的温度一般都比较高，而水汽的蒸发方向是向上的，因此倒置平皿不会失水过多，可以延缓干燥速度。
六、注意事项
1、细菌涂片不宜太厚，否则细菌容易重叠，影响脱色效果。
2、火焰固定不宜过热，做到玻片不烫手背即可。
3、乙醇脱色是关键操作，脱色过度阳性菌会被误染成阴性菌，脱色不足，阴性菌会被误染成阳性菌。
4、划线的时候要做到无菌，盖子尽量往平皿一边放，不要置于平皿的正上方，避免误染等，手在进行操作时要先用酒精消毒。
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