RWPE-1人正常前列腺上皮细胞的培养步骤与应用！

2023-05-26 11:02阅读：

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RWPE-1人正常前列腺上皮细胞的培养步骤与应用！

一、背景

RWPE-1人正常前列腺上皮细胞来自一位54岁白人男性的正常前列腺组织切片的周围区域的上皮细胞用单拷贝的人乳头瘤病毒18（HPV-18）进行转化，建立了RWPE-1。

RWPE-1细胞在三维Matrigel培养时，在雄激素刺激下，形成腺胞（acini）并向培养基中分泌PSA。当与Matrigel或基质细胞混合注射雄性裸鼠时，RWPE-1细胞也能形成腺胞并产生PSA。来源于RWPE-1的细胞用Kirstin鼠肉瘤病毒（Ki-MuSV）转染Ki-ras基因，建立了能成瘤的RWPE-2细胞和RWPE2-W99细胞。另外，用N-甲醇-N-硝基脲（MNU）处理RWPE-1，建立了一系列模拟前列腺癌进程中不同时期的成瘤细胞株。它们分别是WPE1-NA22,WPE1-NB14,WPE1-NB11和WPE1-NB26细胞。RWPE-1细胞经过检测后发现乙肝病毒、丙肝病毒和人免疫缺陷病毒都呈阴性。PCR证实该细胞系HPV病毒DNA序列呈阳性。每个批次均通过本库支原体检测，结果阴性。

二、细胞培养步骤

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1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备K-SFM培养基；添加对应因子牛垂体提取物BPE及人重组表皮生长因子EGF（0.05 mg/ml BPE+5 ng/ml EGF）；双抗，1%。

注意：细胞消化时需要用带血清的培养基来终止。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

用于微透析法研究左氧氟沙星在前列腺和血中的药代动力学及RWPE-1细胞摄取特征研究：

建立起高效液相色谱法（HPLC）来检测微透析液中左氧氟沙星的浓度,利用微透析技术研究左氧氟沙星在比格犬的前列腺和颈静脉中的药代动力学。建立起HPLC法来检测细胞中左氧氟沙星的浓度,研究药物进入人正常前列腺上皮细胞（RWPE-1）的特征。

方法：HPLC检测左氧氟沙星的浓度,采用Kromasil-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钾溶液（15:85）,柱温30,紫外检测波长为294 nm,进样量10μl。

利用透析法、反透析法测定血管同心圆探针体外相对回收率,分析药物浓度、流速对相对回收率的影响。利用反透析法测定颈静脉、前列腺中探针的体内相对回收率,考察体内12 h的回收率稳定性。基于体内、外校正的结果,以合适的流速进行颈静脉和前列腺中的药代动力学研究。

建立起HPLC法来检测细胞中左氧氟沙星的浓度,考察其线性范围、精密度、回收率以及稳定性。考察不同时间、浓度、温度以及有无P-糖蛋白抑制剂情况下,左氧氟沙星进入RWPE-1的特征。结果在0.1～50.0μg/ml浓度范围内左氧氟沙星的HPLC分析方法线性关系良好（R2=0.997）,且专属性良好,高浓度质控样品、中浓度质控样品、低浓度质控样品、定量下限的精密度、准确度等均符合分析要求。体外实验中,血管同心圆探针的正向回收率和反向回收率差异没有统计学意义（P>0.05）,药物浓度不影响体外回收率,且回收率随流速的增大回收率减小。体内实验中,颈静脉和前列腺中的探针相对回收率不随浓度的变化而变化,且相对回收率在12 h内稳定。药代动力学实验中,血液和前列腺中的药代动力学参数分别是t1/2（4.74±1.31）和（3.75±2.64）h,Cmax（24.86±3.31）和（15.48±1.56）μg/ml,Tmax（0.61±0.40）和（1.06±0.96）h,AUC0-t为（80.55±28.12）和（50.97±6.74）μg·h/ml,AUC0-∞（115.82±41.20）和（67.77±23.16）μg·h/ml,MRT（6.61±1.49）和（5.48±3.15）h。

细胞中左氧氟沙星的分析方法浓度范围为在0.05～5.0μg/ml,回归曲线方程:Y=53132X-556.13,R2=1。精密度、回收率和稳定性均符合要求。左氧氟沙星浓度4～160μg/ml范围内,摄取量开始呈增加趋势随后趋于饱和。在37和4下,前者条件下的细胞平均摄取量高于后者。

P–糖蛋白抑制剂实验组与空白对照组的药物摄取量没有统计学意义（P>0.05）,但是前者的平均摄取量高于后者。结论所建立的HPLC分析方法可用于左氧氟沙星微透析探针的测定,反透析法可用于测定左氧氟沙星微透析探针的体内相对回收率。体内校正和药代动力学流速为1.5μl/min。

左氧氟沙星在血中与前列腺中的分布不平衡,可能是由于存在于前列腺组织的MRP4蛋白外排转运作用影响。所建立的HPLC分析方法可用于细胞中左氧氟沙星浓度的测定,细胞摄取时间为15 min,P–糖蛋白可能参加了左氧氟沙星在RWPE-1细胞中摄取过程。

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