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1、人结肠腺癌细胞培养基及培养冻存条件准备：
1)准备：DMEM+10S+1%P/S
2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液：50sal medium+40S+10%DMSO。
2、人结肠腺癌细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。
3）人结肠腺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
人结肠腺癌细胞可以用于MiR-492调控CD147表达对结肠癌细胞LS174T奧沙利铂耐药性的影响的研究：
研究建立了奥沙利铂耐药结肠癌S174T/L-OHP细胞系,运用该细胞系开展体外实验,可以简化并很好的模拟结肠癌对奥沙利铂耐药的发展。利用此细胞系深入研究耐药的分子机制,可能有助于发展有效治疗方式,将耐药肿瘤细胞逆转为对化疗敏感的细胞。进而发展新型靶向治疗,攻克肿瘤细胞对化疗耐药的问题,这也正是目前结肠癌治疗的一个热点。
研究通过开展体内外细胞生长实验,旨在阐明miR-492/CD 147轴在结肠癌细胞奥沙利铂耐药中的关键功能调控作用。研究结果提示miR-492通过调节CD147,促进结肠癌对奥沙利铂的耐药。CD147可能成为对抗结肠癌奥沙利铂耐药的一个新型治疗靶点。
方法：
1、建立LS174T/L-OHP寸药细胞系本实验所采用的方法是逐步递增培养液中L-OHP浓度、间歇作用于人结肠腺癌细胞,对其进行体外诱导筛选而获得。应用MTT法分别检测倍比稀释浓度的L-OHP对其细胞的抑制率,进而确认所建立细胞系具有良好的耐药性和稳定性。
2、分析Mi R-492/CD147在结肠癌细胞LS174T及耐药细胞LS 174T/L-OHP中的表达实时PCR分析LS 174T/L-OHP和LS174T细胞内miR-492和CD147的mRNA表达水平。Western blot检测LS 174T/L-OHP和人结肠腺癌细胞中CD147的表达水平。揭示miR-492/CD147可能参与人结肠腺癌细胞对奥沙利铂耐药的过程。
3、敲低LS 174T/L-OHP细胞CD147表达对LS 174T/LOHP细胞耐药性的影响RNA干扰技术敲低LS 174T/L-OHP细胞CD147表达后,MTT实验结果检测LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的耐药性的影响。
4、下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492表达对CD147蛋白水平的影响采用miRNA抑制体转染LS 174T/L-OHP细胞的方法,下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492的表达对CD147蛋白水平的影响。
5、上调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492表达对CD147蛋白水平的影响转染pre-mi R-492外源性上调miR-492,检测LS174T/L-OHP细胞中CD147蛋白含量,双荧光素酶检测CD147 3’-UTR的启动子荧光素酶活性,进而MTT法检测LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的耐药性。
6、体内实验用裸鼠肿瘤耐药细胞,外源性上调miR-492,检测其对CD147的调控作用,同时监测肿瘤体积来揭示miR-492/CD147对肿瘤细胞耐药性的影响。
结果：在本研究中,发现与对照组结肠癌LS174T细胞相比,奥沙利铂耐药细胞LS 174T/L-OHP中miR-492的表达水平较低,CD147的表达水平则更高。在LS 174T-L-OHP中,我们还发现敲低CD147可以增强LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的敏感性。
采用miRNA抑制体转染LS 174T/L-OHP细胞的方法,下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492的表达,CD147表达水平升高；外源性导入pre-miR-492上调miR-492,可以下调CD147的表达水平,同时提高肿瘤细胞对奥沙利铂的敏感性。此外,给奥沙利铂耐药移植瘤注入miR-492,能够提高耐药细胞对药物的响应。
1)准备：DMEM+10S+1%P/S
2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液：50sal medium+40S+10%DMSO。
2、人结肠腺癌细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。
3）人结肠腺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
人结肠腺癌细胞可以用于MiR-492调控CD147表达对结肠癌细胞LS174T奧沙利铂耐药性的影响的研究：
研究建立了奥沙利铂耐药结肠癌S174T/L-OHP细胞系,运用该细胞系开展体外实验,可以简化并很好的模拟结肠癌对奥沙利铂耐药的发展。利用此细胞系深入研究耐药的分子机制,可能有助于发展有效治疗方式,将耐药肿瘤细胞逆转为对化疗敏感的细胞。进而发展新型靶向治疗,攻克肿瘤细胞对化疗耐药的问题,这也正是目前结肠癌治疗的一个热点。
研究通过开展体内外细胞生长实验,旨在阐明miR-492/CD 147轴在结肠癌细胞奥沙利铂耐药中的关键功能调控作用。研究结果提示miR-492通过调节CD147,促进结肠癌对奥沙利铂的耐药。CD147可能成为对抗结肠癌奥沙利铂耐药的一个新型治疗靶点。
方法：
1、建立LS174T/L-OHP寸药细胞系本实验所采用的方法是逐步递增培养液中L-OHP浓度、间歇作用于人结肠腺癌细胞,对其进行体外诱导筛选而获得。应用MTT法分别检测倍比稀释浓度的L-OHP对其细胞的抑制率,进而确认所建立细胞系具有良好的耐药性和稳定性。
2、分析Mi R-492/CD147在结肠癌细胞LS174T及耐药细胞LS 174T/L-OHP中的表达实时PCR分析LS 174T/L-OHP和LS174T细胞内miR-492和CD147的mRNA表达水平。Western blot检测LS 174T/L-OHP和人结肠腺癌细胞中CD147的表达水平。揭示miR-492/CD147可能参与人结肠腺癌细胞对奥沙利铂耐药的过程。
3、敲低LS 174T/L-OHP细胞CD147表达对LS 174T/LOHP细胞耐药性的影响RNA干扰技术敲低LS 174T/L-OHP细胞CD147表达后,MTT实验结果检测LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的耐药性的影响。
4、下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492表达对CD147蛋白水平的影响采用miRNA抑制体转染LS 174T/L-OHP细胞的方法,下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492的表达对CD147蛋白水平的影响。
5、上调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492表达对CD147蛋白水平的影响转染pre-mi R-492外源性上调miR-492,检测LS174T/L-OHP细胞中CD147蛋白含量,双荧光素酶检测CD147 3’-UTR的启动子荧光素酶活性,进而MTT法检测LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的耐药性。
6、体内实验用裸鼠肿瘤耐药细胞,外源性上调miR-492,检测其对CD147的调控作用,同时监测肿瘤体积来揭示miR-492/CD147对肿瘤细胞耐药性的影响。
结果：在本研究中,发现与对照组结肠癌LS174T细胞相比,奥沙利铂耐药细胞LS 174T/L-OHP中miR-492的表达水平较低,CD147的表达水平则更高。在LS 174T-L-OHP中,我们还发现敲低CD147可以增强LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的敏感性。
采用miRNA抑制体转染LS 174T/L-OHP细胞的方法,下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492的表达,CD147表达水平升高；外源性导入pre-miR-492上调miR-492,可以下调CD147的表达水平,同时提高肿瘤细胞对奥沙利铂的敏感性。此外,给奥沙利铂耐药移植瘤注入miR-492,能够提高耐药细胞对药物的响应。