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三、细胞培养操作步骤
（一）HFF-1细胞复苏：
1、冻存管从液氮或-80冰箱中取出放入PE手套中，迅速没入37水浴锅，摇晃冻存管加速溶解，以1min内全部溶解为宜；
2、在超净台中将溶解好的细胞液加入到装有9mL完全培养基的离心管内，1000-1200rpm离心5min，弃去上清液，用1-2mL完全培养基重悬细胞；
3、将细胞悬液加入到含有5-6mL完全培养基的T25瓶中，放入培养箱培养。
（二）HFF-1细胞传代：
1、将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入1-2mL胰酶（0.25%Trypsin+0.02TA）；
2、镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时（可用吸管吸起些许胰酶轻轻吹打细胞层某处，肉眼可见细胞层脱落，即消化完成，否则继续消化），直接吸掉胰酶，加入5-6mL完全培养基，轻轻吹打细胞层，把细胞层吹落，吹散；
3、将细胞悬液按1:2比例分到新的T25瓶中，添加适当的完全培养基，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养；
4、注意培养基pH值变化和细胞密度，定期换液（每周2-3次），待细胞密度达到80%-90%时，重复传代操作或者冻存。
（三）HFF-1细胞冻存：
收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例：
1、细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.
2、1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
3、将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
四、应用
HFF-1可以用于胎儿皮肤来源干细胞的鉴定及其细胞功能的相关研究：
胎儿组织来源的干细胞,可能具有更低的免疫原性和更强的增殖与分化能力,更有希望降低细胞的异体移植引起的免疫排斥风险而更适用于异体移植,同时在短期内可为细胞治疗提供充足的细胞来源,因而具有独特的优势与研究潜能。
实验提取人胎儿皮肤的干细胞,并将其命名为胎儿皮肤来源干细胞(Fetal Dermal-derived Stem Cells;FDSCs),在裸鼠全层皮肤缺损创面中初步探究该细胞是否具有促进创面愈合的作用,并对该细胞进行鉴定和增殖与迁移力检测。从而为应用FDSCs治疗创面或将其做为组织工程皮肤的种子细胞提供实验研究证据。
目的：
1、通过裸鼠全层皮肤缺损创面模型研究FDSCs是否具有促进创面愈合的作用;
2、通过细胞形态学、表面标志物的检测和诱导分化实验,对FDSCs进行鉴定,分析其是否是一种间充质干细胞。
3、通过与创面治疗研究最多的脂肪间充质干细胞(ADSCs)和人皮肤成纤维细胞(HFF-1)进行增殖与迁移力的对比分析,研究FDSCs是否具有更好的创面修复功能。
方法：
1、在裸鼠背部作1.2cm全层皮肤缺损创面模型,实验组在缺损创缘沿皮下注射不同剂量FDSCs,对照组注射细胞培养基以及不做任何处理的空白对照,分别在0、3、7、10、14天时观察拍照,比较不同组创面愈合率,并取皮肤标本作病理检测分析。
2、对三种细胞进行传代培养并观察细胞形态、采用流式细胞术检测三种细胞间充质干细胞(MSCs)相关表面标志物表达情况,进一步对三种细胞进行成脂、成骨分化诱导,从而鉴定FDSCs是否是一种间充质干细胞。
3、采用CFSE染色法对FDSCs、ADSCs、HFF-1三种细胞同时进行染色,培养一段时间后通过荧光表达量计算三种细胞的相对增殖率;使用六孔培养板同时培养三种细胞,同时对三种细胞进行划痕实验比较三种细胞的迁移率。
结果：
1、与对照组相比,FDSCs注射组裸鼠创面在3、7、10、14天均表现出更高的创面愈合率,且中(5x106)、高(1x107)剂量细胞注射组创面愈合率增高明显,结果具统计学意义。病理检测结果显示,FDSCs注射组表皮增厚,皮肤再上皮化增强。
2、FDSCs、ADSCs、HFF-1的细胞形态无明显差异,均呈长梭形、呈典型的成纤维细胞样形态。细胞表面标志物检测显示:三种细胞均表达MSCs相关表面标志物,即CD44、CD73、CD90、CD105呈阳性表达,表达百分比在90%以上;造血细胞相关标志物CD14、CD45、CD34均呈阴性表达;与异体移植免疫排斥相关的表面分子HLA-DR三种细胞均呈阴性表达,但表达百分比FDSCs低于ADSCs和HFF-1。进一步诱导诱导分化实验结果显示,FDSCs、ADSCs均能向脂肪细胞、骨细胞分化,而HFF-1无明显分化迹象。
3、对三种细胞的增殖率和迁移率检测结果均表现出:FDSCs最快、HFF-1次之、ADSCs最慢。
结论：
1、胎儿皮肤来源干细胞能加速裸鼠全层皮肤缺损创面愈合,且中、高剂量组促愈合作用较明显。
2、胎儿皮肤来源干细胞可能是一种胎儿皮肤间充质干细胞。
3、胎儿皮肤来源干细胞较HFF-1及ADSCs增殖与迁移更快,可能具有更好的创面修复功能。
（一）HFF-1细胞复苏：
1、冻存管从液氮或-80冰箱中取出放入PE手套中，迅速没入37水浴锅，摇晃冻存管加速溶解，以1min内全部溶解为宜；
2、在超净台中将溶解好的细胞液加入到装有9mL完全培养基的离心管内，1000-1200rpm离心5min，弃去上清液，用1-2mL完全培养基重悬细胞；
3、将细胞悬液加入到含有5-6mL完全培养基的T25瓶中，放入培养箱培养。
（二）HFF-1细胞传代：
1、将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入1-2mL胰酶（0.25%Trypsin+0.02TA）；
2、镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时（可用吸管吸起些许胰酶轻轻吹打细胞层某处，肉眼可见细胞层脱落，即消化完成，否则继续消化），直接吸掉胰酶，加入5-6mL完全培养基，轻轻吹打细胞层，把细胞层吹落，吹散；
3、将细胞悬液按1:2比例分到新的T25瓶中，添加适当的完全培养基，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养；
4、注意培养基pH值变化和细胞密度，定期换液（每周2-3次），待细胞密度达到80%-90%时，重复传代操作或者冻存。
（三）HFF-1细胞冻存：
收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例：
1、细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.
2、1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
3、将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
四、应用
HFF-1可以用于胎儿皮肤来源干细胞的鉴定及其细胞功能的相关研究：
胎儿组织来源的干细胞,可能具有更低的免疫原性和更强的增殖与分化能力,更有希望降低细胞的异体移植引起的免疫排斥风险而更适用于异体移植,同时在短期内可为细胞治疗提供充足的细胞来源,因而具有独特的优势与研究潜能。
实验提取人胎儿皮肤的干细胞,并将其命名为胎儿皮肤来源干细胞(Fetal Dermal-derived Stem Cells;FDSCs),在裸鼠全层皮肤缺损创面中初步探究该细胞是否具有促进创面愈合的作用,并对该细胞进行鉴定和增殖与迁移力检测。从而为应用FDSCs治疗创面或将其做为组织工程皮肤的种子细胞提供实验研究证据。
目的：
1、通过裸鼠全层皮肤缺损创面模型研究FDSCs是否具有促进创面愈合的作用;
2、通过细胞形态学、表面标志物的检测和诱导分化实验,对FDSCs进行鉴定,分析其是否是一种间充质干细胞。
3、通过与创面治疗研究最多的脂肪间充质干细胞(ADSCs)和人皮肤成纤维细胞(HFF-1)进行增殖与迁移力的对比分析,研究FDSCs是否具有更好的创面修复功能。
方法：
1、在裸鼠背部作1.2cm全层皮肤缺损创面模型,实验组在缺损创缘沿皮下注射不同剂量FDSCs,对照组注射细胞培养基以及不做任何处理的空白对照,分别在0、3、7、10、14天时观察拍照,比较不同组创面愈合率,并取皮肤标本作病理检测分析。
2、对三种细胞进行传代培养并观察细胞形态、采用流式细胞术检测三种细胞间充质干细胞(MSCs)相关表面标志物表达情况,进一步对三种细胞进行成脂、成骨分化诱导,从而鉴定FDSCs是否是一种间充质干细胞。
3、采用CFSE染色法对FDSCs、ADSCs、HFF-1三种细胞同时进行染色,培养一段时间后通过荧光表达量计算三种细胞的相对增殖率;使用六孔培养板同时培养三种细胞,同时对三种细胞进行划痕实验比较三种细胞的迁移率。
结果：
1、与对照组相比,FDSCs注射组裸鼠创面在3、7、10、14天均表现出更高的创面愈合率,且中(5x106)、高(1x107)剂量细胞注射组创面愈合率增高明显,结果具统计学意义。病理检测结果显示,FDSCs注射组表皮增厚,皮肤再上皮化增强。
2、FDSCs、ADSCs、HFF-1的细胞形态无明显差异,均呈长梭形、呈典型的成纤维细胞样形态。细胞表面标志物检测显示:三种细胞均表达MSCs相关表面标志物,即CD44、CD73、CD90、CD105呈阳性表达,表达百分比在90%以上;造血细胞相关标志物CD14、CD45、CD34均呈阴性表达;与异体移植免疫排斥相关的表面分子HLA-DR三种细胞均呈阴性表达,但表达百分比FDSCs低于ADSCs和HFF-1。进一步诱导诱导分化实验结果显示,FDSCs、ADSCs均能向脂肪细胞、骨细胞分化,而HFF-1无明显分化迹象。
3、对三种细胞的增殖率和迁移率检测结果均表现出:FDSCs最快、HFF-1次之、ADSCs最慢。
结论：
1、胎儿皮肤来源干细胞能加速裸鼠全层皮肤缺损创面愈合,且中、高剂量组促愈合作用较明显。
2、胎儿皮肤来源干细胞可能是一种胎儿皮肤间充质干细胞。
3、胎儿皮肤来源干细胞较HFF-1及ADSCs增殖与迁移更快,可能具有更好的创面修复功能。