微生物试剂无菌性测试的具体操作步骤及结果观察与判断！
2026-01-23 15:43阅读：
微生物试剂无菌性测试的具体操作步骤及结果观察与判断！
百欧博伟生物：微生物试剂的无菌性测试是确保试剂（如培养基、稀释液、缓冲液、生物指示剂载体等）在使用前未被微生物污染的关键步骤，核心是通过模拟实际使用条件的培养的培养，检测是否存在活菌。以下是基于《中华人民共和国药典》（ChP）、《美国药典》（USP）或《欧洲药典》（EP）等权威标准的通用操作步骤，具体需结合试剂类型和药典版本调整：
一、测试前准备：环境与物料控制
无菌测试需在Class
100洁净环境下进行（如生物安全柜、无菌隔离器），且所有接触试剂的器具需提前灭菌（如高压蒸汽灭菌、干热灭菌），避免外源污染干扰结果。
环境验证：确认 级洁净区的悬浮粒子、沉降菌符合标准（如
ChP 要求悬浮粒子≥0.5μm 的粒子数≤3500 个 /m³，≥5.0μm 的粒子数≤20 个
/m³），并记录环境监测数据。
器具灭菌：
玻璃器皿（如锥形瓶、移液管、培养皿）：121高压蒸汽灭菌 20 分钟，或
160-170干热灭菌 2-4 小时；
塑料器具（如无菌吸头、离心管）：选择已灭菌的一次性产品，或确认可耐受的灭菌方式（如
γ
射线灭菌）；
稀释液 / 冲洗液（如 0.9%
无菌氯化钠溶液）：需单独做无菌性验证，确保自身无菌。
人员准备：操作人员需穿戴无菌服、手套、口罩，手部消毒后进入洁净区，操作前通过“无菌模拟试验”（如用无菌培养基模拟操作流程，培养后无菌生长）确认操作合规性。
二、样品处理：根据试剂形态选择方法
需根据微生物试剂的物理形态（液体、固体、油剂、膜剂等）设计处理方式，核心是让可能存在的污染菌充分释放到培养基中，同时不破坏试剂稳定性。
试剂类型
处理方法
液体试剂（如稀释液、液体培养基） 直接取样：用无菌移液管吸取 10-20mL
样品（或按试剂说明书规定体积），分别接种至需氧、厌氧、真菌培养基。
固体试剂（如固体培养基粉末、冻干试剂） 复溶/溶解：用无菌稀释液（如 0.9% 无菌氯化钠）按说明书比例复溶，制成均匀液体后，取 10-20mL
接种培养基。
油剂/脂溶性试剂（如石蜡、油相缓冲液）
乳化处理：加入无菌乳化剂（如聚山梨酯 80）或无菌稀释液，在无菌条件下搅拌乳化，使油相分散，再取乳化液接种。
膜剂/吸附型试剂（如无菌滤膜、生物指示剂载体）
冲洗/浸泡：将样品放入无菌锥形瓶，加入足量无菌冲洗液，振荡或浸泡 30 分钟，取冲洗液接种培养基。
三、培养基选择与接种：覆盖所有可能污染菌
无菌测试需覆盖需氧菌、厌氧菌、真菌三类微生物，因此需选择针对性培养基，并采用“直接接种法”或“薄膜过滤法”（适用于含抑菌成分的试剂）接种。
1、常用培养基及培养条件
微生物类型
培养基举例 培养温度 培养时间
观察指标
需氧菌 胰酪大豆胨液体培养基（TSB） 30-35 ≥14 天
培养基浑浊、产生沉淀或气泡
厌氧菌 硫乙醇酸盐流体培养基（FTM） 30-35 ≥14 天 培养基（还原层）浑浊
真菌 沙氏葡萄糖液体培养基（SDB） 20-25 ≥14 天 培养基浑浊、产生菌丝
2、接种操作（以直接接种法为例）
取 3 份待测试剂样品（每份体积按说明书规定，如
10mL），分别接种至需氧菌培养基、厌氧菌培养基、真菌培养基中；
同时设置阳性对照（接种已知菌，如需氧菌用金黄色葡萄球菌、厌氧菌用生孢梭菌、真菌用白色念珠菌）和阴性对照（仅接种无菌培养基，无样品）；
接种后轻轻摇匀培养基，按上述条件避光培养（厌氧菌需在厌氧培养箱或厌氧袋中培养，避免氧气干扰）。
四、结果观察与判断：排除假阳性 /
假阴性
培养期间需定期（如第 7 天、第 14
天）观察培养基状态，重点关注“是否有微生物生长迹象”，并结合对照结果判断：
1、对照结果有效性判断
阳性对照：培养后需出现明显微生物生长（如 TSB 浑浊、FTM
还原层浑浊），证明培养基和培养条件有效；
阴性对照：培养全程需澄清透明，无任何生长迹象，证明操作环境、器具无外源污染。
若对照结果无效，需重新进行无菌测试。
2、样品结果判断
合格（无菌）：待测试剂对应的 3
种培养基均澄清透明，无任何微生物生长迹象，且对照结果有效；
不合格（有菌）：任一培养基出现浑浊、沉淀、气泡、菌丝等生长迹象，需进一步验证（如取浑浊培养基划线接种至固体培养基，培养后观察菌落形态，确认是否为污染菌）；
可疑结果：若培养基出现轻微浑浊，但无法确定是否为微生物生长，可延长培养至
21 天，或取样品重新测试，若仍有可疑迹象，判定为不合格。
五、异常情况处理与记录
污染溯源：若样品测试不合格，需排查污染来源（如试剂生产过程、储存环节、测试操作污染），并记录溯源过程；
重新测试：仅当“明确污染由测试操作失误导致”（如阴性对照污染）时，可重新取样测试；若怀疑试剂本身污染，需扩大取样量（如取 3
倍批量样品）重复测试；
记录存档：完整记录测试过程，包括环境监测数据、样品信息、培养基批次、培养条件、观察结果、对照情况等，存档至少
3 年（或符合法规要求的保存期限）。
六、关键注意事项
抑菌成分干扰：若试剂含抑菌剂（如抗生素、防腐剂），直接接种会抑制污染菌生长，导致假阴性，需采用薄膜过滤法（用无菌滤膜截留样品中的微生物，再将滤膜转移至培养基培养，去除抑菌成分干扰）；
培养基适用性验证：每次使用新批次培养基前，需做“适用性验证”（接种已知菌，确认能正常生长），避免培养基失效；
法规合规性：不同国家/地区的药典对无菌测试的细节要求略有差异（如培养时间、培养基配方），需根据试剂的目标市场选择对应的标准。
通过以上步骤，可科学、准确地验证微生物试剂的无菌性，避免因试剂污染导致后续实验（如食品微生物检测、药品无菌检查）结果偏差。
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