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微生物检测中,对培养基的无菌操作有哪些具体要求?

2026-02-09 13:49阅读:
微生物检测中,对培养基的无菌操作有哪些具体要求?



百欧博伟生物:在微生物检测中,培养基作为微生物生长繁殖的营养基础,其无菌性直接影响检测结果的准确性(如避免假阳性、确保目标菌正常生长)。对培养基的无菌操作需贯穿制备、灭菌、储存、使用全流程,具体要求如下:

一、培养基制备过程的无菌要求

1、原料与器具清洁

培养基原料(如蛋白胨、琼脂、盐类等)需符合纯度标准,避免引入杂菌;称量时使用清洁、干燥的无菌容器(如灭菌烧杯),避免原料被环境微生物污染。

制备用玻璃器皿(烧杯、玻璃棒、漏斗等)需提前灭菌(高压蒸汽灭菌或干热灭菌),或用 75% 酒精彻底擦拭后晾干,防止残留微生物污染培养基。

2、溶解与分装规范

溶解培养基时,搅拌工具需无菌(如灭菌玻璃棒),避免接触非无菌表面;加热溶解过程中,容器口需覆盖无菌纱布,防止空气中微生物落入。

分装至试管或锥形瓶时,需在超净工作台内操作,容器口靠近酒精灯火焰,避免液体溅出污染瓶口;分装量不宜过多(如试管不超过 1/3 容积),方便后续灭菌和使用。


二、培养基灭菌的核心要求

1、灭菌方法选择

大多数培养基采用高压蒸汽灭菌:121、103.4kPa(1.05kg/cm²)条件下维持 20-30 分钟(含升温至设定温度的时间),确保杀灭包括芽孢在内的所有微生物。

对热敏感的培养基(如含有维生素、抗生素的培养基),需采用过滤灭菌:使用 0.22μm 孔径的无菌滤膜过滤,去除微生物后分装至无菌容器。

2、灭菌过程控制

灭菌前需检查高压灭菌器的压力表、温度表是否正常,确保灭菌参数准确;灭菌锅内物品摆放不宜过密,保证蒸汽流通充分。

灭菌结束后,待压力降至 0MPa、温度降至 80以下再打开锅盖,避免因压力骤降导致培养基沸腾溅出污染;取出后需立即检查容器是否破损、封口是否严密,如有破损需废弃。

三、灭菌后培养基的无菌储存要求

1、暂存与标记

灭菌后的培养基需在超净工作台内冷却(如倒平板需冷却至 50-60),避免冷却过程中吸入空气中的微生物;未立即使用的培养基需密封(如试管加硅胶塞、锥形瓶加无菌棉塞),标记名称、灭菌日期和有效期。

固体培养基(如琼脂平板)需倒置存放于 4冰箱,避免冷凝水滴落污染培养基表面;液体培养基需直立存放,防止瓶口污染。

2、有效期管理

一般灭菌后的培养基有效期为:4冷藏条件下 1-2 周(具体根据培养基类型调整,如血琼脂培养基需在 24 小时内使用),超过有效期需重新灭菌或废弃。

使用前需观察培养基是否变质(如浑浊、长菌、颜色异常、出现沉淀),若有异常则判定为污染,禁止使用。

四、培养基使用过程的无菌操作

1、取用规范

打开培养基容器(如试管、培养皿)时,需在超净工作台内操作,容器口靠近酒精灯火焰,用手旋转打开盖子(避免直接拉开导致气流带入微生物),取出后立即盖紧盖子,减少暴露时间。

倒平板时,培养皿需提前灭菌,打开皿盖时仅揭开一条缝隙(约 1/3),倒入培养基后迅速盖紧,轻轻摇匀使培养基均匀分布,待凝固后倒置存放。

2、接种时的防护

接种操作需在超净工作台内进行,接种环、移液枪头等工具需灭菌后使用;滴加或划线时,避免工具接触培养基边缘或皿盖内侧,防止污染。

一次未用完的培养基(如剩余的液体培养基),需在瓶口火焰灭菌后密封,标记剩余量和使用日期,冷藏保存并尽快用完(一般不超过 24 小时)。

五、培养基无菌性验证要求

每批次灭菌后的培养基需进行无菌检查:取少量培养基(如 10-20mL 液体培养基或 1-2 个平板),在 37恒温培养箱中培养 24-48 小时,观察是否有菌落生长。

若无菌检查发现污染,需立即排查灭菌过程(如参数是否达标、灭菌器是否故障)、储存环境或操作环节的问题,废弃该批次培养基并重新制备。

通过严格执行以上操作,可确保培养基在整个生命周期内保持无菌状态,为微生物检测提供可靠的营养环境,避免因培养基污染导致检测结果失真。

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