酵母菌直接镜检计数法的核心原理与适用场景及操作步骤！
2026-02-12 14:38阅读：
酵母菌直接镜检计数法的核心原理与适用场景及操作步骤！
百欧博伟生物：酵母菌直接镜检计数法是通过血细胞计数板（或血球计数板）在显微镜下直接观察并统计细胞数量的方法，核心优势是快速便捷，能在
10-20 分钟内获得结果，但计数的是活菌与死菌的总和。
一、核心原理与适用场景
该方法利用血细胞计数板上固定体积的计数室，将稀释后的酵母菌悬液滴入计数室，在显微镜下数出特定区域的细胞数，再通过公式换算成每毫升样品中的总细胞数。
适用场景：
需快速获得细胞数量的场景（如发酵过程中酵母菌增殖速度监测）。
对计数精度要求不高，且无需区分活菌与死菌的实验（若需区分活菌，需结合染色法，如美蓝染色）。
样品中酵母菌浓度较高（通常需≥10
CFU/mL，浓度过低会导致计数误差大）。
二、关键器材准备
血细胞计数板：常用规格有两种，计数室体积均为
0.1mm³（即 10 mL），仅计数格数量不同，后续计算公式需对应调整。
25×16 型：计数室分为 25 个中格，每个中格又分为 16 个小格，共 400 个小格。
16×25 型：计数室分为 16 个中格，每个中格又分为 25 个小格，共 400 个小格。
盖玻片：需配套血细胞计数板的专用厚盖玻片（厚度约
0.17mm），避免因盖玻片过薄导致计数室体积不准。
显微镜：普通光学显微镜即可，需具备 40 倍物镜（高倍镜）和 10
倍目镜。
稀释液：根据样品特性选择，常用无菌生理盐水（0.85% NaCl
溶液）或无菌蒸馏水，若样品含杂质，可加入少量亚甲蓝（0.1%）染色，使细胞更易区分。
移液器与吸头：建议使用 10μL 或 20μL
移液器，确保滴加体积准确。
三、详细操作步骤（以 25×16
型计数板为例）
1、样品稀释：确保计数室细胞数在合理范围
若酵母菌浓度过高（如培养液），需用无菌稀释液梯度稀释，最终目标是：滴入计数室后，每个中格的细胞数约为
5-10 个，避免细胞重叠或过少导致误差。
举例：若预估样品浓度为 10 CFU/mL，可稀释 100 倍（先
1:10 稀释，再取 1mL 稀释液加 9mL 稀释液），使浓度降至 10 CFU/mL 左右。
2、计数板与盖玻片处理
用无水乙醇擦拭计数板和盖玻片，去除残留杂质，然后用镜头纸轻轻擦干（避免划伤计数室刻度）。
将盖玻片放在计数板的计数室上方，轻轻按压，确保盖玻片与计数板之间无气泡（若有气泡需重新放置，否则会影响细胞分布）。
3、滴加样品：控制体积，避免溢出
用移液器吸取 10μL
稀释后的酵母菌悬液，滴在盖玻片边缘（计数室与盖玻片的缝隙处），利用毛细作用使液体自然渗入计数室，直至充满但不溢出（若溢出，需用吸水纸吸干后重新滴加）。
静置 5-10
分钟，让酵母菌细胞沉降到计数室底部，避免显微镜下观察时细胞漂移。
4、显微镜观察与计数：遵循“计上不计下、计左不计右”原则
先将计数板放在显微镜载物台上，用低倍镜（10
倍物镜）找到计数室的方格线，再切换到高倍镜（40 倍物镜）聚焦。
选择计数室中的5 个中格（通常选四角和中央的中格，共 5
个），逐个数出每个中格内的酵母菌细胞数。
计数规则：细胞压线时，只计“上缘线”和“左缘线”上的细胞，“下缘线”和“右缘线”上的细胞不计（避免重复计数）；若细胞团块中细胞清晰可分，需按单个细胞计数，若团块紧密无法区分，可忽略或记为
1 个（需在结果中注明）。
5、结果计算：代入公式换算总浓度
血细胞计数板的计数室体积固定为0.1mm³ = 10
mL，计算公式需根据计数板规格调整：
25×16 型计数板：
每毫升样品中酵母菌数 = 5 个中格的总细胞数 × 5（换算成 25
个中格的总细胞数） × 10（换算成 1mL 体积） × 稀释倍数
16×25 型计数板：
每毫升样品中酵母菌数 = 4 个中格的总细胞数 × 4（换算成 16
个中格的总细胞数） × 10（换算成 1mL 体积） × 稀释倍数
示例：用 25×16 型计数板，5 个中格共数出 80
个细胞，样品稀释了 100 倍，则：
每毫升酵母菌数 = 80 × 5 × 10 × 100 = 4×10
CFU/mL
四、关键注意事项：减少误差的核心要点
稀释度准确性：稀释时需充分振荡样品（尤其是固体样品或细胞团块较多的样品），确保细胞均匀分散，否则会导致局部浓度偏差。
计数室清洁：若计数板刻度上有残留细胞或杂质，需用蒸馏水冲洗后重新擦拭，避免干扰计数。
重复计数验证：为提高精度，建议对同一样品进行 2-3
次平行计数（每次更换新的稀释液滴加），若两次结果误差超过 10%，需重新计数。
区分活菌与死菌：若需仅计数活菌，可在稀释液中加入 0.1%
美蓝溶液（染色 5 分钟），活菌因细胞膜完整不被染色，死菌会被染成蓝色，计数时只统计无色细胞即可。
避免细胞沉降不均：滴加样品后静置时间不足，细胞会悬浮在液体中，导致显微镜下观察时细胞模糊或漂移；静置时间过长（超过
30 分钟），细胞可能黏附在计数室底部，影响后续清洗。
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