血细胞计数板操作的准备工作与核心步骤及结果计算！
2026-02-13 13:35阅读：
血细胞计数板操作的准备工作与核心步骤及结果计算！
百欧博伟生物：血细胞计数板操作需严格遵循“准备 - 加样 - 计数 -
清洗”四步流程，核心是确保加样量准确、计数规则统一，以避免结果偏差。
一、操作前准备：工具与样品预处理
1、工具准备与清洁
准备血细胞计数板（如改良牛鲍计数板）、配套盖玻片、移液管（10μL 或
20μL）、显微镜、无菌生理盐水（或样品稀释液）、吸水纸、镜头纸。
用清水冲洗计数板和盖玻片，再用无水乙醇擦拭晾干，确保计数室（中央方格区域）无污渍、划痕，避免影响观察。
2、样品稀释（关键步骤）
若酵母悬液浓度过高（如肉眼可见浑浊），需用无菌生理盐水梯度稀释，目标是让稀释后菌液中，每 0.1μL
计数室内的细胞数在5~50 个（太少会导致误差大，太多会重叠难以计数）。
举例：若预估原始浓度为
10个 /mL，可先稀释 100 倍（取 1mL 菌液 + 99mL 稀释液），再取稀释液 1mL+9mL 稀释液，最终稀释 1000
倍（10³）。
若需区分死活细胞，可在稀释液中加入少量 0.1% 美蓝染液（菌液：染液
= 10:1），室温静置 3~5 分钟后再计数（活菌无色，死菌蓝色）。
二、加样与镜检：核心操作步骤
1、放置盖玻片
将干净的盖玻片平放在计数板的“计数室区域”（两个计数室，左右各一个），确保盖玻片边缘与计数板的凹槽对齐，此时盖玻片与计数室表面会形成一个高度为0.1mm的密闭空间（计数室体积的关键来源）。
2、滴加样品
用移液管吸取稀释后的酵母悬液，在盖玻片的一侧边缘缓慢滴加（每次滴加
10~15μL 即可），利用 “毛细作用” 让菌液自动充满计数室，避免产生气泡。
注意：不要直接滴在计数室中央，也不要挤压盖玻片，若菌液溢出或有气泡，需擦去重新加样（气泡会导致细胞分布不均，影响计数）。
3、静置与调焦
加样后将计数板放在显微镜载物台上，室温静置3~5
分钟，让酵母细胞充分沉降到计数室底部（避免细胞悬浮导致观察时模糊）。
先使用10× 物镜（低倍镜）找到计数室的方格轮廓，再切换到40×
物镜（高倍镜），调节细准焦螺旋，直到能清晰看到圆形 / 椭圆形的酵母细胞（细胞壁清晰，无重影）。
三、细胞计数：遵循统一规则
1、确定计数区域
改良牛鲍计数板的计数室为“中央大方格”，内部包含 25 个中方格，每个中方格又包含 16
个小方格（即“25×16”规格）；部分计数板为“16×25”规格（16 个中方格，每个含 25
个小方格），两种规格计数逻辑一致。
通常选择4 个角的中方格 + 中央 1 个中方格，共 5
个中方格进行计数（覆盖区域均匀，减少误差）。
2、计数规则（避免重复 / 遗漏）
核心规则：计上不计下，计左不计右。即当细胞压在方格线上时，只统计“方格上边线”和“左边线”上的细胞，“下边线”和“右边线”上的细胞不计入，避免同一细胞被多次统计。
若细胞成团（如 2~3
个细胞连在一起），需判断是否为单个细胞聚集：若能清晰区分细胞壁，按单个细胞计数；若完全融合无法区分，需舍弃该团（或在记录中注明，避免结果偏高）。
3、数据记录
分别记录 5
个中方格内的细胞总数（若区分死活，需分别记录无色活菌数和蓝色死菌数），计算平均值（如 5 个中方格共计数 150
个细胞，则平均每个中方格 30 个）。
四、结果计算与工具清洗
1、浓度计算（关键公式）
以“25×16”规格计数板为例，公式如下：
原始菌液浓度（个 /mL）= 5 个中方格总细胞数 × 5（换算成 1
个大方格细胞数） × 10（体积换算系数） × 稀释倍数
公式解读：5 个中方格是 1 个大方格（计数室）的 1/5，因此 ×5
得到 1 个大方格（体积 0.1μL）的细胞数；1mL=10个 0.1μL，因此 ×10；最后 ×
稀释倍数，抵消稀释带来的浓度降低。
示例：5 个中方格共 120 个细胞，稀释倍数 1000 倍，则原始浓度
= 120×5×10×1000=6×10个 /mL。
2、工具清洗与保存
计数完成后，立即用清水冲洗计数板和盖玻片，去除残留菌液（若有顽固污渍，可用软毛刷轻轻刷洗计数室，避免划伤）。
冲洗后用无水乙醇擦拭晾干，将计数板放入专用盒中，盖玻片单独存放，避免受潮或污染。
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